本发明属于生物领域，特别涉及细菌的计数方法，具体为一种确定细黄连霉菌培养物中细菌数量的方法。
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：近来有关细黄连霉菌的研究引起了越来越多的关注。其中的菌落计数是微生物制剂有关研究的基础，如研究细黄连霉菌的培养条件、增殖特性、使用剂量、制剂含菌量等等均离不开细菌计数。细菌计数的方法有计数器测定法、电子计数器计数法、平板菌落计数法、比浊法、测定细胞重量法、测定细胞总氮量或总碳量、颜色改变单位法等，其中比浊法和菌落计数法可满足绝大多数细菌的计数且也是最常用的方法。菌落计数法是根据每个活的细菌能培养长出一个菌落的原理设计的，不需要特殊仪器，操作简单，测定时取一定容量的菌悬液作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数，此法灵敏度高，是一种检测活菌数的好方法，但该法费时，至少需24小时才能出结果，且需判断选择好适宜的稀释度(一般选取菌落数在30-300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确)，因此其操作的复杂性、花费及时间等均增大。比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。但光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响，且通常只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品或组织样品等，不能用此法测定，但此法简便快捷。比浊法测定细菌的数量主要的关键是如何排除样品中的干扰物、所采用的光波波长的确定和测定的OD值与细菌数量间对应关系，否则只能判断出相对的细菌数目而不能确定出准确的细菌数目。目前，利用紫外分光光度计来测定细黄连霉菌数量还需摸索。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种确定细黄连霉菌培养物中细菌数量的方法，该方法快速简单，使用于细黄连霉菌液体培养液中细菌的技术。为实现上述目的，本发明的技术方案为：确定细黄连霉菌培养物中细菌数量的方法，包括以下步骤：取待检样品设置梯度稀释倍数(表1)，得到梯度稀释溶液，测定并记录OD600值与细菌数量，根据统计方法建立起细菌数量与稀释倍数和OD600值的函数关系，得到细菌数量与稀释倍数和OD600值的相关系数；利用所述函数关系和所述相关系数计算出细黄连霉菌液体培养物的细菌数量；所述相关系数为2.5。表1、稀释倍数及菌落总数稀释倍数OD600值(nm)菌落总数(CFU/ml)50.9126.245×101070.8945.661×101090.8695.157×1010100.8443.865×1010120.8153.124×1010140.7412.595×1010160.6492.595×1010180.5772.595×1010200.5192.595×1010220.4722.595×1010240.43252.595×1010260.3992.595×1010280.3712.595×1010300.3462.595×1010320.3242.595×1010进一步，所述稀释倍数是指所述稀释溶液相对于所述待检样品的体积稀释倍数。进一步，所述函数关系为：细菌数量＝OD600值×稀释倍数×2.5×109CFU/mL。进一步，所述OD600值为0.1-0.8。将洗涤干净的样品用稀释液稀释至OD600值不大于0.1-0.8，仅在上述范围内，OD600值与细菌数量才存在线性关系。超出上述范围，将导致计数出现误差或错误。快速确定细黄连霉菌液体培养物中细菌数量的方法，具体步骤为：取样品并洗涤，所取的样品指细黄连霉菌液体培养物，也可以是其他培养物，或形状和细黄连霉菌液体培养物相似的样品；洗涤的目的在于去除其它杂物，避免后期读取OD600值时受其他杂物影响而产生误差，将洗涤干净的样品用稀释液稀释至OD600值不大于0.8得稀释菌液，记录稀释倍数，所述稀释倍数是指所述稀释菌液相对于所述样品的体积稀释倍数；根据统计方法建立起细菌数量与稀释倍数和OD600值的函数关系，得到细菌数量与稀释倍数和OD600值的相关系数，所述函数关系为：细菌数量＝OD600值×稀释倍数×2.5×109CFU/mL。具体思路是：将经具体确认细菌(细黄连霉菌)数量的样品与该样品的OD600值统计分析得到的系数。进一步，所述细黄连霉菌培养物为液体培养物或菌液。进一步，所述待检样品在稀释前进行3-5次的离心洗涤。作为一种优选，所述离心洗涤用生理盐水连续离心洗涤。进一步，离心洗涤的条件为：3000-5000转/分钟，离心5-10分钟。本发明的有益效果在于：本发明提供一种快速确定细黄连霉菌液体培养物中细菌数量的方法，该方法简便、快速，结果准确，填补了利用紫外分光光度计准确测定细黄连霉菌的细菌数这一空白。1)实现了利用仪器自动化检测和计数。传统的细菌培养计数是人工操作，因此结果的可靠性与检测人员的经验有较大的影响，仪器自动化检测表明了检测方法的进步。2)传统的细菌计数涉及培养试剂选择与准备、培养基的制备、培养条件的准备、多步骤的人工操作等，因此操作复杂，需要具有微生物学知识特别是要掌握细黄连霉菌的培养特性。本发明操作简便，无微生物学和细黄连霉菌知识的人员根据操作步骤即可测定。3)传统的霉菌培养计数不仅操作复杂，且培养时间需3-7天，而本发明可在0.5-1小时出结果，大大地缩短了检测时间。4)确定了检测所采用的光波波长和所测定的OD值与细黄连霉菌数量间的对应关系，结果准确。本发明根据菌悬液的透光量可反映测定样品中的细菌的数量，对比浊法测定细菌的数量的两个主要的关键一测定所采用的光波波长和所测定的OD值及稀释倍数与细黄连霉菌数量间对应关系进行了摸索，确定了OD值及稀释倍数与细黄连霉菌数量间对应关系，同时，本发明通过用生理盐水连续离心洗涤所测定的菌液，除去样品中的干扰物，结果准确。具体实施方式下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例样品为细黄连霉菌CSY1-3-10-1株用高氏合成培养基30-40℃通气发酵24小时后，检测发酵液中细黄连霉菌的含菌数。取发酵菌液lml作为样品。方法1计数器计数法：取上述样品，用血细胞计数器进行计数。取1ml该样品，置于血细胞计数器的计数室内，三名技术员各用显微镜计数三次，以降低主观错误的可能。每毫升该发酵液中细黄连霉菌的含菌数为2.595×1010CFU/ml，约为260亿个。方法2取上述样品进行离心。对于上述样品，分别设置两种条件离心，条件1为：以3000转/分钟离心10分钟样品后，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心5000转/分钟，5分钟，洗涤3次；条件2为：以5000转/分钟离心5分钟，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心3000转/分钟，10分钟，洗涤3次。每次离心后，均去除上清液，取沉淀物。将沉淀物用生理盐水作20倍体积的稀释，得稀释菌液，记录稀释倍数，所述稀释倍数是指所述稀释菌液相对于所述样品的体积稀释倍数；于紫外分光光度计下测定600nm处OD值(注意用生理盐水调0)，测得OD600nm值为0.519。根据以下公式计算出菌液含菌量，含菌总数(CFU/ml)＝OD600nm值×20×2.5×109CFU/mL＝0.519×20×2.5×109CFU/ml＝2.595×1010CFU/mL。即每毫升该发酵液中细黄连霉菌的含菌数约为260亿个。公式中的系数“2.5”是经过多次实验得到的经验系数，具体思路是：将经具体确认细菌(细黄连霉菌)数量的样品与该样品的OD600值统计分析得到的系数。当公式采用其它系数，会出现细菌计数误差。另外，平行设置其它稀释倍数组，所得稀释菌液的OD600nm值在0.1-0.8内，带入上述公式计算，所得细菌(细黄连霉菌)数量与稀释体积呈线性关系。方法3取上述样品进行离心。对于上述样品，分别设置两种条件离心，条件1为：以3000转/分钟离心10分钟样品后，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心5000转/分钟，5分钟，洗涤3次；条件2为：以5000转/分钟离心5分钟，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心3000转/分钟，10分钟，洗涤3次。每次离心后，均去除上清液，取沉淀物。将沉淀物用生理盐水作24倍体积的稀释，得稀释菌液，记录稀释倍数，所述稀释倍数是指所述稀释菌液相对于所述样品的体积稀释倍数；于紫外分光光度计下测定600nm处OD值(注意用生理盐水调0)，测得OD600nm值为0.433。根据以下公式计算出菌液含菌量，含菌总数(CFU/ml)＝OD600nm值×24×2.5×109CFU/mL＝0.433×24×2.5×109CFU/ml＝2.595×1010CFU/mL。即每毫升该发酵液中细黄连霉菌的含菌数约为260亿个。公式中的系数“2.5”是经过多次实验得到的经验系数，具体思路是：将经具体确认细菌(细黄连霉菌)数量的样品与该样品的OD600值统计分析得到的系数。当公式采用其它系数，会出现细菌计数误差。另外，平行设置其它稀释倍数组，所得稀释菌液的OD600nm值在0.1-0.8内，带入上述公式计算，所得细菌(细黄连霉菌)数量与稀释体积呈线性关系。方法4取上述样品进行离心。对于上述样品，分别设置两种条件离心，条件1为：以3000转/分钟离心10分钟样品后，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心5000转/分钟，5分钟，洗涤3次；条件2为：以5000转/分钟离心5分钟，在离心的样品中添加生理盐水，连续离心3000转/分钟，10分钟，洗涤3次。每次离心后，均去除上清液，取沉淀物。将沉淀物用生理盐水分别作5、6、7、8、9、10、11和12倍体积的稀释，得稀释菌液，记录稀释倍数，所述稀释倍数是指所述稀释菌液相对于所述样品的体积稀释倍数，于紫外分光光度计下测定600nm处OD值(注意用生理盐水调0)5、6、7、8、9、10、11和12倍体积的稀释测得OD600nm值大于0.8。所计数的5组含菌总数(CFU/ml)与稀释体积不呈线性关系，不予考虑。上述三种方法中，方法2，方法3与方法1计数结果一致。但是，方法1中，计数器计数法必须依赖于显微镜；而且计数器计数法是通过肉眼观察后进行计数，计数过程中由于主观原因产生的误差不易被察觉，必须通过多人计数来降低误差。所以，本方法有一定的优势。而方法4中，稀释倍数与检测结果缺少线性关系。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3