一种Cas9/RNA系统及其应用的制作方法

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体是一种cas9/rna系统及其应用。

背景技术：

由于化石燃料的不可再生，以及燃烧化石燃料释放的co2造成的温室效应的影响，发展可靠，环境友好，经济可行的替代能源已经成为我国以及世界的一项重要的任务。生物燃油是一种对现用汽油的极具吸引力的替代品。现在的可再生液体燃料主要用食物为原料进行生产的。现在的生物燃料包括从油脂农作物(例如：大豆、棕榈树、动物脂肪、地沟油)中提取的生物柴油、生物乙醇和其它的提取自甘蔗和谷类的醇类、h2、长链的烃和沼气(scottetal.,2010)。生产以农作物为来源的生物燃料需要大量的可耕种土地，这会和种植可食用农作物竞争土地，导致了一个“食物vs燃料”的矛盾。最近，高产油微藻被认为是一种可以生产用于运输的高质量汽油的有前途的可再生原料(beeretal.,2009；chisti,2007)。

理想的微藻生物燃料藻株应该可以快速生长，高生物量，高油脂含量，容易收集，抗病性强。虽然已知的微藻种类多余500,000，但是直到现在，也仅有有限的几种微藻被认为是潜在的生物能源生产藻株，但是没有被认为是理想的。为获得经济可行的工业生物能源微藻，对微藻的驯化和基因工程改造是必须的。

基因工程是了解和改造微藻油脂生物合成过程中关键的工具。随机插入(rochaixandvandillewijn,1982)，同源重组(nelsonandlefebvre,1995)，rnai(schrodaetal.,1999)，锌指核酸内切酶(schrodaetal.,1999)，talen技术(daboussietal.,2014)等已经被运用到了微藻的基因工程改造。crispr/cas9系统是最近在细菌和古细菌中发现的一种rna介导的控制病毒入侵和消除质粒的适应性免疫系统。从2013年起，cas9/grna系统已经被广泛的应用于特定的基因组改造中。cas9/grna系统仅需要对rna进行替换便可对新的基因位点进行敲除，因此，与锌指核酸酶和talens技术相比，cas9/grna系统更容易被编辑。此外，cas9/grna系统还可以通过对基因组双链的打断提高同源重组效率，但未见在宿主体内可以持续表达cas9/grna，并对宿主进行传代连续敲除的报道。

同时，近几年对于被归类为眼点藻纲，不等鞭毛门(不等鞭毛们还包含褐藻和硅藻)的海洋微拟球藻(nannochloropsissp.)的研究逐步提升，不等鞭毛们还包含褐藻和硅藻。而这种藻株的油脂组成和油脂含量都已经被研究过(danielewiczetal.,2011；schneiderandroessler,1994；sukenikandcarmeli,1990；tononetal.,2002)。此外，微拟球藻在不同条件下的生长状态在最近几年被迅速研究(huandgao,2003；rodolfietal.,2009；srinivasandochs,2012；xuetal.,2004)。而且，nannochloropsisoceanica(pidkowichetal.,2007；wangetal.,2014)和nannochloropsisgaditana(radakovitsetal.,2012)的基因组已经被几个研究小组测序，而且在世界范围内，微拟球藻已经变成了研究基于co2的油脂生产的新的模式藻株。

但是，采用cas9/grna系统对藻株进行基因改造并未有相关报道，因此其具有潜在经济意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种cas9/rna系统及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种cas9/rna系统，cas9/rna系统为筛选标记、cas9蛋白基因和rna的编码dna；其中，cas9蛋白基因为：编码与rna结合并对目的基因进行敲除的蛋白质基因；rna的编码dna为能够指导cas9蛋白进行基因切割的rna的编码dna。

一种cas9/rna系统，其特征在于：cas9/rna系统为筛选标记、cas9蛋白基因和rna的编码dna；其中，cas9蛋白基因为：编码与rna结合并对目的基因进行敲除的蛋白质基因；rna的编码dna为能够指导cas9蛋白进行基因切割的rna的编码dna，所述cas9/rna的核苷酸序列如seqno:2所示。

所述筛选标记的抗性基因为潮霉素抗性基hyg等敏感基因。

优选，所述cas9蛋白基因为经过密码子优化并能完整编码的cas9蛋白的基因；rna的编码dna为一条或者两条能与cas9蛋白结合构成二级结构，并指导cas9蛋白对目的位置或随机目的位置剪切的rna的编码dna。

进一步优选，所述cas9蛋白基因为酿脓链球菌的cas9蛋白基因；朴氏菌属，弗朗西斯氏菌属的cpf1蛋白基因或已知的任何一种cas9蛋白等；

所述rna的编码dna为grna的编码dna。

更进一步优选，所述cas9蛋白基因为经过密码子优化并能完整编码的酿脓链球菌的cas9蛋白基因；弗朗西斯氏菌属的cpf1蛋白基因等。所述cas9的蛋白的核苷酸序列为seqno:1所示，同时其氨基酸序列如seqno:3所示。

所述rna的编码dna为带有可以形成茎环结构的grna的编码dna并在其5，端修饰带有15-25个碱基序列。

更进一步优选，所述cas9/rna的核苷酸序列如seqno:2所示。

cas9/rna系统的应用，所述cas9/rna系统在原核、真核或病毒的定点基因或随机基因改造中的应用。

所述cas9/rna系统在制备目的基因被敲除的原核、真核或病毒定点或随机突变中的应用。

所述cas9/rna系统在制备目的基因被敲除的原核、真核或病毒定点连续或随机连续突变中的应用。

一种基于cas9/rna系统的载体，载体为所述cas9/rna系统插入骨架载体的限制性内切酶位点，得到载体。

所述骨架载体为分别适用于原核、真核或病毒的载体。

一种基于cas9/rna系统的载体的应用，所述载体在原核、真核或病毒的定点基因或随机基因改造中的应用。

所述载体在在制备目的基因被敲除的原核、真核或病毒定点连续或随机连续突变中的应用。

一种藻类基因改造的方法，将所述cas9/rna系统或载体导入藻株中，使系统中cas9蛋白在rna的指导下，对藻株中核酸序列的待敲除目的基因位点或随机位点进行酶切，酶切后的核酸序列自我修复过程中实现目的位点突变或随机位点突变，而后通过npcr/re-ngs联合方式确定突变株；

或，酶切后的核酸序列自我修复，进行目的位点或随机位点突变，而后随着藻株细胞传代培养过程中，实现目的位点或随机位点的连续不断突变，而后通过npcr/re-ngs联合方式确定突变株。

具体，将人工合成同时表达微拟球藻密码子优化后cas9蛋白，grna和微拟球藻抗性基因的载体，将载体以电击方法导入微拟球藻，通过npcr/re-ngs联合使用的方法鉴定有无突变产生，再进一步筛选单克隆确定突变株；在确定突变株后藻株继续生长，在生长状态下可实现该位点的连续不断突变。

所述转化方法为电击转化，还可以为任何已知的转化方法。所述微拟球藻，还可以是已知的任何藻类、植物、哺乳动物或农作物。所述鉴定方法是npcr/re-ngs鉴定方法，还可以是已知的任何鉴定方法。所述扩增目的基因的方法是npcr法，还可以是已知的任何的pcr方法。所述的敲除的目的基因可以为任何一段或几段微拟球藻藻dna序列。

本发明所具有的优点：

本发明运用cas9/crispr定点进行基因改造的方法。在微拟球藻中过表达的cas9蛋白和rna组成复合物，cas9蛋白在rna的指导下定点切割基因组双链dna，进而引发基因突变，可以极大的提高微拟球藻的藻种改良效率；而后再利用npcr/re-ngs鉴定方法可以有效的鉴定cas9/grna产生的低频突变，从而最终鉴定突变株。

本发明建立的微拟球藻的cas9/grna系统对微拟球藻进行代谢工程改造，进而加强油脂合成。同时将本发明cas9/grna系统作用与其它作物上也可以大大加速农作物育种的过程，作用于其它生物上可以大大加速生物的育种速度。

附图说明

图1a为本发明获得的以潮霉素基因为筛选标记的cas9/grna系统表达载体物理图谱。

图1b为本发明实施例提供的采用图1acas9/grna系统表达载体对硝酸还原酶敲除位点图。

图2为本发明实施例提供的cas9蛋白和异源表达rna在微拟球藻中转录水平鉴定；其中，a为cas9蛋白在微拟球藻中转录水平鉴定；b为grna在微拟球藻中转录水平鉴定。

图3为本发明实施例提供的npcr/re-ngs方法筛选转化株电泳检测结果；其中，a为提取库基因组dna酶切，npcr后对扩增产物酶切，电泳检测结果；b为提取库基因组dnanpcr后，对扩增产物酶切，电泳检测结果。

图4为本发明实施例提供的npcr/re-ngs方法高通量测序结果图；其中，a为突变株提取基因组后进行npcr，对扩增产物进行酶切，电泳检测结果；b为突变株突变位点的5bp缺失突变；c为突变株突变位点的5bp缺失突变测序结果。

图5为本发明实施例提供的突变株的表型鉴定图，其中，a为野生型和突变株在硝酸钠培养条件下的生长曲线；b为野生型和突变株在氯化铵培养条件下的生长曲线；c为野生型和突变株在硝酸钠和氯化铵培养基中培养10天后的滤膜过滤图片。

表2a为本发明实施例提供的提取库基因组dna酶切，npcr，对5号库npcr产物送高通量测序后突变统计结果。

表2b为本发明实施例提供的提取库基因组dna进行npcr，对5号库npcr产物送高通量测序后突变统计结果。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明的方法及该方法所达到的效果做进一步说明。

本发明获得突变株的方法，是指利用电击方法将含有本发明的cas9/grna系统导入藻株,通过cas9/grna系统的cas9蛋白在异源表达rna的指导下将目的基因定点敲除，实验中只要通过替换异源表达rna的用来识别靶序列的序列便可以实现对不同位点的敲除，而后通过npcr/re-ngs联合方式确定突变株。所述目的基因硝酸还原酶基因实施例：实现硝酸还原酶基因在微拟球藻中的定点敲除

cas9/rna系统为筛选标记、cas9蛋白基因和grna的编码dna；其中，cas9蛋白基因为：经过密码子优化并能完整编码的酿脓链球菌的cas9蛋白基因；grna的编码dna为可以形成一定茎环结构，并与cas9蛋白结合的rna序列其5`端带有cagagcaagggcttcagctg的碱基序列(参见图1b)；筛选标记为潮霉素抗性基因。

利用所述cas9/grna系统在微拟球藻的硝酸还原酶基因改造中的应用。

具体是，采用上述cas9/rna系统在制备目的基因被敲除的藻突变株的方法，将上述cas9/rna系统导入待敲除目的基因的藻株中，使系统中cas9蛋白在rna的指导下，对藻株中核酸序列的待敲除目的基因位点进行酶切，酶切后的核酸序列自我修复过程中实现目的位点突变，而后通过npcr/re-ngs联合方式确定突变株。

具体是，

(1)将上述cas9蛋白，潮霉素，grna的编码dna通过现有公知技术分别在不同的启动子下游分别表达，而后通过人工dna合成方法合成(参见图1a)；其中，cas9的核苷酸序列如seqno:1所示。cas9/rna的核苷酸序列如seqno:2所示。cas9蛋白后连接有ha标签，核定位信号(nls)，由黄质/叶绿体a结合蛋白(g2383)启动子(pvcp)启动,α-微管蛋白(g5608)终止子终止(tatub)。sgrna基因由v型atpase(g335)启动子(patpase)启动，铁氧还原蛋白(g2604)终止子(tfd)终止，潮霉素抗性基因由β-微管蛋白(g1388)启动子(pbtub)启动，黄质/叶绿体a结合蛋白(g2383)终止子(tvcp)终止。pvcp：1-616；微拟球藻密码子优化后的cas9序列：623-4729；ha标签：4730-4756；sv40nls：4775-4795；sv40nls：4802-4822；核质蛋白nls：4838-4885；tatub：4895-5513；pbtub：5562-5979；hygr：5980-6996；tvcp：7003-7483；patpase：7490-7654；硝酸还原酶grna：7655-7757；tfd：7758-8031；载体骨架：8032-12086。

(2)载体的cassette的构建

将构建好的载体利用pcr引物f:5-aaggcgattaagttgggta-3和r:5-tggcacgacaggtttcc-3进行扩增，获得带有cas9蛋白，潮霉素，grna的线性化载体的pcr产物，pcr产物按照常规方式进行cyclepure纯化，制作用于转化的cassette。

(3)电穿孔方法将cassette导入微拟球藻中并挑选单克隆

在转化前1h，取浓度为对数生长期的微拟球藻藻液，6000g离心，弃上清，漂洗，取100ml对数生长期的微拟球藻藻液，5000g离心5min，弃上清，375mm洗2次，最后用2ml山梨醇重悬藻体。将浓缩藻液分装为200μl的小份，每份加入3μg线性化载体和1μl变性处理的鲑鱼精dna(15μg/ml)，混匀后冰置10min。将混合物转移入2mm电击杯，以2200v(hv)，50μf进行电击，电击后立即将藻体转移入5ml新鲜f/2培养基。25℃摇床中100rpm，弱光复苏48h。细胞被涂布到含潮霉素(300μg/ml)以nh4cl作为唯一氮源的f/2固体平板，培养25天之后，挑100个单克隆放到一个三角瓶中作为一个库，重复挑10个三角瓶，建立10个库，共计1000个转化株，培养14天。用植物组织提取试剂盒(omega)提取各个库的dna，-20℃保存。对转化后的微拟球藻根据trizol说明书提取rna，并利用takara反转录试剂盒根据说明书反转录rna后，进行pcr鉴定。如图2所示，cas9(a)和grna(b)在转化株中被成功表达。

(4)npcr/re-ngs方法筛选转化株

设计扩增硝酸还原酶敲除位点上下游序列npcr引物。cas9切割位置为酶切位点。对提取的基因组一部分进行酶切，同时也以未酶切的基因组为模板分别进行npcr扩增，分别对npcr扩增产物进行再次酶切鉴定，对有未切开条带的npcr产物高通量测序；具体

首先，设计可以扩增敲除位点上下游dna序列的npcr引物(参见下表1)。其次，取部分提取的各个库的基因组dna和野生型基因组dna，对靶序列位置进行限制性内切酶(pvuii)酶切。再次，分别以酶切后基因组dna和未酶切的基因组dna为模板进行npcr扩增(扩增产物大小395bp)。最后，对npcr扩增产物进行酶切后琼脂糖凝胶电泳检测(图3)。如图3中a所示，对提取的基因组进行酶切之后进行npcr扩增，npcr产物酶切，在5号瓶有明显的未酶切条带。b所示，对提取的基因组进行npcr扩增之后，用pvuii酶切，同样在5号瓶所处有微弱的未酶切条带。两次实验结果都说明5号瓶中有突变产生。取扩增产物不能被完全切开的npcr扩增产物进行ngs测序，鉴定有何种突变产生。高通量测序之后发现在酶切位点处有未切开的5bp和12bp缺失突变(表2)。5bp突变概率为1.22％，而12bp突变概率为0.04％，推测5bp突变株为挑单克隆时已经发生突变的转化株，而12bp突变株为在传代过程中发生突变的转化株，因此其突变概率远小于1％。对5号瓶转化株涂平板进行培养，之后挑取300个转化株分别进行液体培养。提取转化株基因组dna，npcr扩增，酶切鉴定，对无法酶切的npcr产物进行测序，获得硝酸还原酶基因5bp缺失的突变株(图4)。图4中a为对突变株进行npcr扩增，并对扩增产物进行pvuii酶切，扩增产物不能被pvuii酶切，证明有突变产生，对npcr产物进行测序，测序结果显示在酶切位点处有5bp缺失突变产生(图4中b和c)。

表1敲除位点上下游dna序列的npcr引物

表2a突变体库dna被pvuii酶切后的npcr扩增子测序结果

表2b突变体库dnanpcr扩增子测序结果

五、突变株表型鉴定

野生型和突变株分别在以nano3或nh4cl为唯一氮源的f/2培养基中进行培养。转化株被培养在含50mlf/2培养基的250ml三角瓶中，测量od75010天(图5)。从图中看，野生型可以在nano3和nh4cl培养基中正常生长。然而，突变株只能在nh4cl培养基中生长，说明，突变株的硝酸还原酶基因突变，cas9/grna系统成功将微拟球藻中硝酸还原酶基因敲除。

实施例2

实现硫酯酶g9763在微拟球藻中的定点敲除

cas9/rna系统为筛选标记、cas9蛋白基因和grna的编码dna；其中，cas9蛋白基因为：经过密码子优化并能完整编码的酿脓链球菌的cas9蛋白基因；grna的编码dna为可以形成一定茎环结构，并与cas9蛋白结合的rna序列其的5`端带有tcgaacggaaagtgtgtggg的碱基序列；筛选标记为潮霉素抗性基因。

(2)载体的cassette的构建

将构建好的载体利用pcr引物f:5-aaggcgattaagttgggta-3和r:5-tggcacgacaggtttcc-3进行扩增，获得带有cas9蛋白，潮霉素，grna的线性化载体的pcr产物，pcr产物按照常规方式进行cyclepure纯化，制作用于转化的cassette。

(3)电穿孔方法将cassette导入微拟球藻中并挑选单克隆

在转化前1h，取浓度为对数生长期的微拟球藻藻液，6000g离心，弃上清，漂洗，取100ml对数生长期的微拟球藻藻液，5000g离心5min，弃上清，375mm洗2次，最后用2ml山梨醇重悬藻体。将浓缩藻液分装为200μl的小份，每份加入3μg线性化载体和1μl变性处理的鲑鱼精dna(15μg/ml)，混匀后冰置10min。将混合物转移入2mm电击杯，以2200v(hv)，50μf进行电击，电击后立即将藻体转移入5ml新鲜f/2培养基。25℃摇床中100rpm，弱光复苏48h。细胞被涂布到含潮霉素(300μg/ml)以nh4cl作为唯一氮源的f/2固体平板，培养25天之后，挑100个单克隆放到一个三角瓶中作为一个库，重复挑10个三角瓶，建立10个库，共计1000个转化株，培养14天。用植物组织提取试剂盒(omega)提取各个库的dna，-20℃保存。对转化后的微拟球藻根据trizol说明书提取rna，并利用takara反转录试剂盒根据说明书反转录rna后，进行pcr鉴定。如图2所示，cas9(a)和grna(b)在转化株中被成功表达。

(4)npcr/re-ngs方法筛选转化株

设计扩增硝酸还原酶敲除位点上下游序列npcr引物。靶序列位置有酶切位点。对提取的基因组一部分进行酶切，同时也以未酶切的基因组为模板分别进行npcr扩增，分别对npcr扩增产物进行再次酶切鉴定，对有未切开条带的npcr产物高通量测序；具体

首先，设计可以扩增敲除位点上下游dna序列的npcr引物(参见下表1)。其次，取部分提取的各个库的基因组dna和野生型基因组dna，对靶序列位置进行限制性内切酶(pvuii)酶切。再次，分别以酶切后基因组dna和未酶切的基因组dna为模板进行npcr扩增(扩增产物大小395bp)。最后，对npcr扩增产物进行酶切后琼脂糖凝胶电泳检测。取扩增产物不能被完全切开的npcr扩增产物进行ngs测序。鉴定是否有突变产生。涂平板进行培养，根据测序结果，挑取单克隆进行培养。提取基因组dna，npcr扩增，酶切鉴定，对无法酶切的pcr产物进行测序，获得转化株(图3)。由图3结果显示，5号瓶npcr产物有没有酶切开的npcr产物，对5号瓶两种npcr产物进行高通量测序之后发现在酶切位点处有未切开的5bp和12bp缺失突变。

表1敲除位点上下游dna序列的npcr引物

五、突变株表型鉴定

野生型和突变株分别在以nano3或nh4cl为唯一氮源的f/2培养基中进行培养。转化株被培养在含50mlf/2培养基的250ml三角瓶中，测量od75010天(图5)

实施例3

实现硫酯酶g9763在微拟球藻中的定点敲除

cas9/rna系统为筛选标记、cas9蛋白基因和grna的编码dna；其中，cas9蛋白基因为：经过密码子优化并能完整编码的酿脓链球菌的cas9蛋白基因；grna的编码dna为可以形成一定茎环结构，并与cas9蛋白结合的rna序列其的5`端带有aattgggatttgaagacgg的碱基序列；筛选标记为潮霉素抗性基因。

将构建好的载体利用pcr引物f:5-aaggcgattaagttgggta-3和r:5-tggcacgacaggtttcc-3进行扩增，获得带有cas9蛋白，潮霉素，grna的线性化载体的pcr产物，pcr产物按照常规方式进行cyclepure纯化，制作用于转化的cassette。

(3)电穿孔方法将cassette导入微拟球藻中并挑选单克隆

在转化前1h，取浓度为对数生长期的微拟球藻藻液，6000g离心，弃上清，漂洗，取100ml对数生长期的微拟球藻藻液，5000g离心5min，弃上清，375mm洗2次，最后用2ml山梨醇重悬藻体。将浓缩藻液分装为200μl的小份，每份加入3μg线性化载体和1μl变性处理的鲑鱼精dna(15μg/ml)，混匀后冰置10min。将混合物转移入2mm电击杯，以2200v(hv)，50μf进行电击，电击后立即将藻体转移入5ml新鲜f/2培养基。25℃摇床中100rpm，弱光复苏48h。细胞被涂布到含潮霉素(300μg/ml)以nh4cl作为唯一氮源的f/2固体平板，培养25天之后，挑100个单克隆放到一个三角瓶中作为一个库，重复挑10个三角瓶，建立10个库，共计1000个转化株，培养14天。用植物组织提取试剂盒(omega)提取各个库的dna，-20℃保存。对转化后的微拟球藻根据trizol说明书提取rna，并利用takara反转录试剂盒根据说明书反转录rna后，进行pcr鉴定。如图2所示，cas9(a)和grna(b)在转化株中被成功表达。

(4)npcr/re-ngs方法筛选转化株

设计扩增硝酸还原酶敲除位点上下游序列npcr引物。靶序列位置有酶切位点。对提取的基因组一部分进行酶切，同时也以未酶切的基因组为模板分别进行npcr扩增，分别对npcr扩增产物进行再次酶切鉴定，对有未切开条带的npcr产物高通量测序；具体

首先，设计可以扩增敲除位点上下游dna序列的npcr引物(参见下表1)。其次，取部分提取的各个库的基因组dna和野生型基因组dna，对靶序列位置进行限制性内切酶(pvuii)酶切。再次，分别以酶切后基因组dna和未酶切的基因组dna为模板进行npcr扩增(扩增产物大小395bp)。最后，对npcr扩增产物进行酶切后琼脂糖凝胶电泳检测。取扩增产物不能被完全切开的npcr扩增产物进行ngs测序。鉴定是否有突变产生。涂平板进行培养，根据测序结果，挑取单克隆进行培养。提取基因组dna，npcr扩增，酶切鉴定，对无法酶切的pcr产物进行测序，获得转化株(图3，图4)。图3结果显示，5号瓶npcr产物有没有酶切开的npcr产物，对5号瓶两种npcr产物进行高通量测序之后发现在酶切位点处有未切开的5bp和12bp缺失突变。

表1敲除位点上下游dna序列的npcr引物

五、突变株表型鉴定

野生型和突变株分别在以nano3或nh4cl为唯一氮源的f/2培养基中进行培养。转化株被培养在含50mlf/2培养基的250ml三角瓶中，测量od75010天(图5)。

上述记载的seqno:1微拟球藻密码子优化后cas9蛋白核苷酸序列

1atggacaagaagtacagcatcggcctcgacatcggcaccaactctgtcggctgggccgtc

61atcaccgatgagtacaaggtcccctctaagaagttcaaggtcctcggcaacacggaccgc

121cactccatcaagaagaacctcattggcgcactcctcttcgactccggtgagacggcagag

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seqno:2cas9/grna转化cassette的质粒核酸全序列(硝酸还原酶基因为例)。

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seqno:3微拟球藻cas9蛋白序列。

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上述说明近视本发明技术方案概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。

sequencelisting

<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120>一种cas9/rna系统及其应用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>4266

<212>dna

<213>酿脓链球菌

<220>

<221>cas9

<222>(1)..(4266)

<223>

<400>1

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