油菜裂角相关基因及分子标记及应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及油菜裂角相关基因及分子标记及在作物遗传育种及生理上应用。

背景技术：

油菜是我国重要的油料作物，现阶段油菜机收落粒问题严重限制着油菜机械化生产水平的提高，提高油菜栽培品种的抗裂角性是现阶段重要育种目标之一。运用数量遗传学和分子生物学手段，通过抗裂角相关基因定位和克隆，不仅为油菜抗裂角分子机制的研究提供理论依据，而且为分子标记辅助选择培育抗裂角品种奠定坚实基础。目前在油菜中能被利用的抗裂角基因，主要来自于通过转基因获得的遗传改良材料，而相关的材料在品种的审定和推广中，因为受到很多法规限制很难真正应用于生产。

油菜和拟南芥同属十字花科，有相同的进化起源，控制拟南芥角果发育和开裂的基因研究得非常深入。拟南芥中控制角果开裂的基因主要有与果瓣边缘层(即离层)发育有关的fruitfull(ful)(guetal.1998),shatterproof1(shp1)、shatterproof2(shp2)(liljegrenetal.2000)，indehiscent(ind)(liljegrenetal.2004),alcatraz(alc)(rajanietal.2001),replumless(rpl)(roederetal.2003)。而且各基因间存在复杂的网络调控机制(dinnenyandyanofsky2005)。ful基因是第一个鉴定出与离区延伸有关的基因，ful基因作为转录因子能促进角果皮细胞的分化和延伸，liljegren等(2000)证明shp1，shp2能控制离区的分化，促进临近细胞的木质化，但这两类基因同源性较高，而且它们存在功能冗余的活性，即单独突变的突变体不显示突变性状，只有当shp1shp2都突变时，突变体的角果才不开裂。同时ful基因负调控shp基因在离区表达，拟南芥的ful基因转化芥菜性油菜能增强角果的抗裂角性(etal.2006)。油菜与拟南芥角果结构虽然相似，但也存在明显的差异，油菜角果胎坐框突出果瓣并有较长的果喙，而拟南芥角果顶端平滑光秃。基于他们之间结构上的差异，对应得抗裂角基因机制是否一致值得进一步探索。

近年来，随着油菜分子生物学的迅速发展，许多控制裂角的qtl已被定位，但对应抗裂角qtl位点下的关键基因及功能分子标记还没有利用的报道，分析和研究已有角果开裂相关基因的自然遗传变异，研究其机理并通过分子生物学手段调整油菜抗裂角性成为油菜遗传改良的重要突破口。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2，其序列为seqidno.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2的indel序列，所述序列为seqidno.3所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种基于油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2中的indel序列设计的分子标记引物，利用该引物可对具备抗裂角性状的油菜进行筛选，有益于油菜的遗传改良，该引物优选为

if4：acttgggacatagcctaatgatg

ir4：tcgtaccactttgatttcagaca。

本发明还有一个目的在于提供了油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2或油菜裂角相关基因bnshp1-a9中的indel序列在制备抗裂角转基因油菜中的应用。

本发明最后一个目的在于提供了基于油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2中的indel序列设计的分子标记引物在油菜的遗传育种中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

油菜裂角相关基因bnshp1-a9的获得：

(1)利用油菜品系r1和r2杂交，杂种f1代通过小孢子培养生成dh分离群体。

(2)利用多态性引物对dh分离群体进行分子标记分析,获得基因型数据。

(3)把dh分离群体的基因型数据输入joinmap4.0软件，进行遗传连锁图谱的构建；

(4)dh群体的基因型数据(仅限于定位到遗传图谱上的标记)以及两年的抗裂角性状数据输入winqtlcart2.5软件进行qtl定位，其中，位于a9连锁群上的两个相邻但效应相反qtl在dh群体两年中能重复检测到，而且效应值和贡献率稳定。

利用上述技术措施，最终获得了油菜抗裂角指数(sri)性状的qtl位点qsri.a9.1，利用winqtlcart2.5软件分析获得其对油菜抗裂角指数的平均贡献率为11.67％,加性效应为-0.07～-0.15。利用常规pcr及反向pcr的方法，分别获得bnshp1-a9在r1和r2中的全长序列，本发明将r1中的bnshp1-a9称为bnshp1-a9-r1，其序列为seqidno.1所示，将r2中的bnshp1-a9称为bnshp1-a9-r2，其序列为seqidno.2所示。针对r2中indel标记(引物为if4/ir4)可分别在r1中扩增出247bp，在r2中扩增出270bp的条带。

一种基于油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2中的indel序列设计的分子标记引物，只要基于seqidno.3设计的引物均为本发明的保护范围，优选的，所述的引物如下：

if4：acttgggacatagcctaatgatg

ir4：tcgtaccactttgatttcagaca。

油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2或油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2中的indel序列在制备抗裂角转基因油菜中的应用，因为带有bnshp1-a9-r2基因的油菜，bnshp1-a9基因表达量相对较低，从而提高油菜角果的抗裂角性。因此可以通过转反义基因或rnai实验抑制bnshp1-a9基因的表达，也能达到相同的作用。

基于油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2中的indel序列设计的分子标记引物在油菜的遗传育种中的应用，利用所述的引物，对未知的油菜株系进行筛选，可加快油菜抗裂角株系的筛选进度，有利于油菜育种工作。

本发明通过实验研究，发现了一个影响油菜抗裂角性，但不影响油菜角果其他性状的qtl位点，进一步开发了鉴定该位点的基因特异indel引物对。应用本发明的indel位点及引物对可以在油菜早期事先鉴定油菜抗裂角性，而不用等到油菜成熟后通过田间表型鉴定抗裂角性。本发明indel位点及引物对加快了油菜育种进程，在油菜的选择育种领域有广阔的应用前景。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明首次定位到油菜a09上控制抗裂角的负向效应qtl位点，可解释11.26％～12.07％的表型方差。对应bnshp1-a9-r1基因的rnai实验也进一步证明该基因是负向效应，即表达受抑制，抗裂角性增强。在常规育种方法中，角果抗裂角性鉴定要等到成熟期收获后室内鉴定，费时费力且选择效率低下(抗裂角性会一定程度受到成熟期的影响)。进一步利用r1和r2基因组上的差异开发一对indel标记(if4/ir4)，通过基因功能标记检测角果抗裂角不同qtl位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中抗裂角负效qtl点功能基因位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测抗裂角性状功能分子标记，即可预测育种材料的抗裂角性，进而准确快速筛选抗裂角油菜株系。

附图说明

图1为一种油菜抗裂角品系r1和不抗品系r2构建的dh群体在武汉种植时，2013-2014两年角果抗裂角系数(sri)的频率分布图。

结果表明2013年角果抗裂角系数表型呈偏正态分布，2014年角果抗裂角系数表型呈正态分布且变异范围很宽，证明角果抗裂角性受数量性状控制。

图2为位于a9连锁群上的一个抗裂角系数qtl位点lod曲线示意图。

上坐标图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表lod值。

下坐标图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表加性效应值。

图3为r1，r2裂角相关基因bnshp1-a09基因结构差异。

图4bnshp1-a9indel标记if4-f/r在dh群体(a)和自然群体(b)中检测结果。

图5为一种油菜r1×r2_dh群体a9连锁群局部分子标记遗传连锁图谱。

图6为r1，r2不同发育时期bnshp1-a09表达量的检测结果。

(a)1为花蕾(<0.3cm)，2为花蕾(>0.3cm)，3-5分别为初开的花，盛开的花和凋谢的花，6-8为1cm，1.5cm和2cm的雌蕊，(b)分别为角果发育10天，16天，18天，20天和22天后bnshp1-a09的表达模式。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中r1、r2及dh群体在文献“王会，桑世飞，梅德圣等.甘蓝型油菜dh群体抗裂角性的遗传分析。中国油料作物学报，2014,36(4):437－442”公开过，公众可以从中国农科院油料作物研究所获得。

实施例1：油菜裂角相关基因bnshp1-a9的获得：

一、qsri.a9.1定位与克隆

(一)田间实验与抗裂角指数表型测定：

田间试验分别于2013年至2014年秋季在中国农科院油料所阳逻实验站(武汉)，成熟期考察株系或单株的抗裂角指数(sri)，鉴定方法参考专利201310226680.4。具体为将油菜角果在80℃烘干30min，室温封闭保存隔夜后，放入圆柱容器，圆柱容器中放置8个钢珠；采用型号为hq45z摇床，以280rpm转速对圆柱容器进行震荡处理，每两分钟观察一次，共观察5次，每份材料重复3次，利用公式：裂角指数＝∑xi×(6-i)/角果数×总次数计算裂角指数，xi为第i次破损的角果数，1≤i≤5，抗裂角指数＝1-裂角指数。两年的抗裂角指数分布见图1。

(二)基因型鉴定

r1×r2dh群体及亲本，分别在5叶期时取叶片提取dna，并分别标记每个单株，对于dh群体株系，则将具有同一基因型的3个单株进行混合叶片取样，以小区号进行标记，在田间迅速冷冻保存。每个样品dna稀释到10ng/μl左右，设计目标区间引物进行pcr扩增，用聚丙烯酰氨凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。目标基因组区域序列信息来源于darmor-bzh全基因组测序数据，用ssrhunter扫描目标基因组序列中的ssr位点，再利用primer5.0(www.premier5biosoft.com)设计引物，开发多态性标记，用于目标基因组区域有利重组单株的筛选。

(三)qtl定位分析

利用windowsqtlcartographer(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/wqtlcart.htm)对dh群体群体进行复合区间qtl作图定位分析(1000次permutation，p＝0.05水平)。对qsri-a9.1进行初步的定位分析(图2)。对qsri-a9.1进行分子标记开发，用以分子标记辅助育种。

实验结论：利用dh群体定位到一个影响油菜抗裂角性qtl，其中负效应qtl位点qsri.a9.1(抗裂角性基因来源于r2)，影响抗裂角的qtl的lod值为4.76-4.91，能够解释11.26-12.07％的表型变异(表1)。

表1：r1×r2dh群体两年抗裂角性qtl定位

二、序列分析

根据精细定位结果，利用生物信息学手段，最终获得了bnshp1-a9基因序列，bnshp1-a9基因由7个外显子和6个内含子组成，其中，第2-6个外显子长度较短，第1个外显子较长、长度超过800bp(图3)。利用primer5.0设计覆盖整个基因的扩增引物，对亲本r2及r1中的两个bnshp1-a9等位基因扩增并进行序列比对分析，结果显示：在基因组水平上，r1及r2存在诸多差异，包括不同长度的插入、缺失及一些snp位点；在mrna水平上，与r2相比，r1存在一个12bp缺失(第7外显子)及分布于整个mrna上的9个snp位点。

在本发明中，将r2中的bnshp1-a9基因称为bnshp1-a9-r2，其序列为seqidno.2所示；将bnshp1-a9在r1中的基因称为bnshp1-a9-r1，其序列为seqidno.1所示。

表2：bnshp1-a9全长扩增及rt-pcr引物

实施例2：对不同发育时期的r1与r2角果发育组织相应部位取样进行bnshp1-a9表达差异分析。

先以不同的花蕾到开花，直到形成角果发育不同时期，以油菜开花的初期为标准，授粉后角果形成10天后每隔2天取样，根据角果发育时期，每个时期每个材料平行选取角果发育大小均一致的5株作为5个生物学重复，尽量保证切取的角果含有同样比例的离区组织。使用rnapreppureplantkit(tiangen)提取总rna，然后用hiscript^@ii1^ststrandcdnasynthesiskit将rna反转录成第一链cdna，使用2×estaqmastermix(cwbio)、bio-rads1000^tmthermalcycler仪进行rt-pcr反应。rt-pcr引物bnshp1.a9-orf设计于基因编码框两侧，扩增长度为906-908bp，使用actin作为内标，基因特异性引物序列及内标引物序列参见表2。

如图6所示结果：r1和r2在蕾期bnshp1-a09表达量相同，都几乎没表达。但r2在花期表达量明显比r1低很多。在角果形成发育的10天和16天，表达在两材料间差异不显著，角果发育后期的18，20和22天三个时期的r1及r2表达量值差异及显著，p值分别为0.669，0.290及0.337，即两材料在花发育后角果形成18天后该基因的表达量差异显著，在r1中随着角果的发育该基因表达量缓慢减少，但r2中到18天后，该基因基本停止表达，因此抗裂角性的差异主要受目标基因的表达量变化导致。

实施例3：油菜bnshp1-a9-r1抑制表达载体的构建及在油菜中的转化

根据r1材料的bnshp1-a9编码区序列，设计引物扩增部分编码区片段(143bp)引物序列为：ttcttttcggtggtttattc和tgacgatttgttgtgttctct。将其反向连接到topo载体上并重组到pearleygate100中。将载体转化到lba4404中准备转化油菜。

油菜的农杆菌lba4404转化

a.无菌苗的准备：种子经70％乙醇1min，氯化汞(hgcl2)浸泡13-15min，ddh2o洗5次后，平铺于ms培养基(ph5.8)中，琼脂浓度0.8％。油菜无菌苗备用。

b.油菜子叶柄转化：接种根癌农杆菌lba4404于固体培养基lb上，两天后挑取单菌落于50mlyep液体培养基(胰蛋白胨10g+酵母提取物10g+nacl5g+mgso40.5g)中培养。取4-5天无菌苗子叶柄，于菌液中浸泡5-8min，其间轻摇，而后倒去菌液，以无菌滤纸吸去外植体上残留菌液。置于共培养基(ms+0.2mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)+1mg/l2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-d)+200um乙酰丁香酮(as)，ph5.8)，上培养2-3天。

c.将共培养后的外植体转入只含青霉素(car)不含kan的分化培养基中，黑暗条件的温室中进行脱菌与分化培养5-7天。再继代在添加kan筛选压的选择培养基(ms+3mg/l6-ba+0.1mg/lα-萘乙酸(naa)+5mg/l硝酸银(agno3)+400mg/lcar+15mg/lkan；ph5.8)中，进行筛选，待分化出再生绿芽。

d.待再生芽长至1cm时切取小芽移至生根培养基(ms+0.2mg/lnaa+10mg/lkan+400mg/lcar；ph5.8)上,用加car与kan的固体ms培养基筛选。

e.苗生根后，移栽入室外。10天后移栽下土钵。

转化植株的鉴定

(1)用于pcr的转化植株总dna的提取

a.70％乙醇擦洗叶片，称取大约100mg

b.加入600ul抽提缓冲液(0.2mtris－cl，0.25nacl，25mmedta，0.5％sds，ph7.5)，室温快速研磨。

c.1.5mlependorff管中涡旋混匀5-10s。

d.12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，－20摄氏度沉淀过夜。

e.12000rpm，15min，室温。加入70％乙醇200ul泡洗dna沉淀。

f.12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。

g.加无菌水100ul溶解粗提dna沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。

h.以总dna为模板，进行pcr。

(2)pcr程序

pcr反应体系的总体积为20μl，基因组dna模板1ul(约50ng)、1×taq酶反应缓冲液、25mmmgcl21.2ul、2mmdntp1.5ul、10um引物各0.2ul、50％甘油2ul、0.3单位rtaq酶(takara公司),加ddh2o至20μl。依据植物表达载体中目的基因设计并合成跨内含子的pcr引物。(正向引物：ttcttttcggtggtttattc和反向引物tgacgatttgttgtgttctct，反应的时间和温度作如下：94℃3min，94℃45s，59℃45s，72℃2min30s，30cycles，72℃5min。

检测结果显示，阳性对照和大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带，而阴性对照则没有，表明转基因油菜基因组中已经含有外源基因dna片段。

对t1代转基因株系进行表型分析

油菜bnshp1-a9转基因株系及对照完全成熟后收获，油菜取主花序角果并充分烘干后鉴定抗裂角指数。最终结果显示，与非转基因株系相比，部分转基因株系抗裂角性增加，最大的增幅超过15％。

因此bnshp1-a9-r1为一个负性调控基因，r2中的indel序列使得bnshp1-a9-r2基因具备抗裂角性。

实施例4：

基于油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2中的indel序列设计的分子标记引物在油菜的遗传育种中的应用：

基于indel序列(seqidno.3所示)设计的分子标记引物如下：

if4：acttgggacatagcctaatgatg

ir4：tcgtaccactttgatttcagaca。

该基因indel分子标记定位于该抗裂角区间(图5)

(1)田间种植中选r1×r2f2单株套袋自交获得的f3代种子。

(2)在定苗前对f3单株挂牌取样，并提取叶片总dna，利用分子标记if4/ir4对其进行qsri.a9.1基因型的判断，仅保留带型和r2相同的单株，其余带型和r1相同以及杂合的单株全部拔掉(因为if4/ir4是共显性标记，所以保留带型同r2拔掉带型为r1和h的单株)。

带型与r2相同的为仅扩增得到270bp一条带的单株。

(3)在成熟期收获f3单株，并对其进行抗裂角鉴定。结果表明，分子标记if4/ir4基因型和r2相同的单株，其抗裂角性超过r2的比例高达93.4％。可见在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选出抗裂角性油菜株系用于提高油菜遗传改良。

实施例5：

油菜裂角相关基因bnshp1-a9-r2中的indel序列作为分子标记在遗传育种中的普适性：

一、实验材料如下：

(1).中油821，中双4号，中双9号，浙油50，skipton，皖油12号，oc3237；沪油21，华双5号，p10，trigold，av-sap，gsl2，浙双6号，westar，宁油7号，matador，nilla，cibrabra，apomix。

(2).初定位使用的两个亲本材料：r1及r2及其dh群体。

二、基因型检测引物：

引物if4和ir4。

三、基因型检测方法

indel标记的扩增体系及检测程序

分别在5片叶时，提取叶片dna，稀释到10ng/μl浓度的工作液进行pcr扩增。indel标记(if4-f/r)基于等位基因pcr扩增原理开发。具体做法为：根据已知indel位点设计特异正向引物(if4-f:acttgggacatagcctaatgatg)，反向引物(if4-r:tcgtaccactttgatttcagaca)，3％琼脂糖凝胶，电压5v/cm电泳检测pcr产物。

pcr扩增体系为：2×taqmix5ul,forwardprimer(10um/ul)1μl,reverseprimer(10um/ul)1μl,gdna1μl,ddh2o2μl,total10μl。

pcr反应条件：94℃，3min；94℃，30s；58℃，30s，72℃，45s；35个循环；72℃，10min；4℃，tilluse。

分别扩增获得bnshp1-a9-r2片段大小为270bp，而bnshp1-a9-r1大小为237bp，用琼脂糖电泳检测即可区分条带差异，显示indel结果。

可以从图4中看到，中油821，中双4号，中双9号，浙油50，skipton，皖油12号，oc3237为具有r1indel标记的7份自交系；沪油21，华双5号，p10，trigold，av-sap，gsl2，浙双6号，westar，宁油7号，matador，nilla，cibrabra，apomix则为具有r2indel标记的13份自交系：因此本发明提供的分子标记在已有的油菜品系中具有普适性，适用于抗裂角油菜筛选。

sequencelisting

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>油菜裂角相关基因及分子标记及应用

<130>油菜裂角相关基因及分子标记及应用

<160>5

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>2737

<212>dna

<213>甘蓝型油菜

<400>1

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atagagataaagaggatagagaacacaacaaatcgtcaagtaaccttctgcaaacgacgc120

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<211>2757

<212>dna

<213>甘蓝型油菜

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