运输载体核酸适配体序列及其用于制备细胞内分子成像或靶向药物传输的用途的制作方法

本发明属于生物医学和分子生物学的技术领域，涉及一种与多种细胞运输载体相关的核酸适配体用于制备活体细胞内分子成像和靶向药物传输试剂或者制品上的用途。

背景技术：

核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,selex)技术从体外人工筛选得到的，能与相应配体专一性紧密结合的一类rna或单链dna(ssdna)分子。核酸适配体通过二、三级结构的折叠形成特定的三维空间构型，与靶分子高亲和性、高特异性地相互作用。

细胞靶向给药是提高治疗效果减少毒副作用的有效途径。由于核酸适配体的可控释，易修饰，载药性及可工业化生产等优点，将药物偶联于核酸适配体上渐渐成为靶向给药的主要方法。以核酸适体介导或修饰的药物及药物纳米制剂，为主动靶向细胞给药系统构建开拓了新方向。目前如sirna,药物，毒素，酶，荧光基团，放射性物质已经被报道通过核酸适配体介导成功转运进入细胞。

在靶向药物传递中，核酸适配体靶向药物传递体系显示出了对疾病组织较高的特定靶向性，而且几乎不与正常细胞结合，因此可极大地提高药效，并降低药物副作用。但是大部分核酸适配体不能主动穿透细胞，随着纳米生物技术的不断提高，polyethyleneglycol(peg)-functionalizedpoly(d,l-lactic-co-glycolicacid)(plga)纳米颗粒,脂质体纳米结构,细胞穿透性多肽cell-penetratingpeptides(cpps)都被用于修饰核酸适配体用于提 高其细胞穿透性。据报道，核酸适配体可以被碳纳米管(cnt)包埋，而用于高效地药物输送。碳纳米管(cnt)作为核酸适配体的载体同时可以极大的提高其细胞内应用稳定性。基于碳纳米管和核酸适体的生物传感器也被用于活体细胞内实时检测。

诊断和治疗的一体化和同步化将是未来分子医学的重要发展方向，设计制备更多具有多功能的分子无疑是这一领域的发展趋势。目前核酸适配体用于生物医学还处于起步阶段，因此开发出一款可以针对多种细胞的通用递质工具的核酸适配体，将极大扩宽核酸适配体的应用范围。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供作为多种细胞运输载体的核酸适配体，以及利用该核酸适配体制备用于活体细胞内分子成像和靶向药物传输试剂或者制品上的用途。核酸适配体c20-1是基于细胞内selex方法筛选出来的核酸适配体。我的研究发现，c20-1核酸适配体可以有效的穿透多种活体细胞如nih3t3(mouseembryonicfibroblastcellline),hff(humanforeskinfibroblast),mef(mouseembryonicfibroblasts)以及raw264.7(mouseleukaemicmonocytemacrophagecellline)。该核酸适配体序列尚未有任何报道，其将为用于活体细胞内分子成像和靶向药物传输提供新的策略。

核酸适配体c20-1，序列为

c20-1：cagggggtgggtgggtggagtgctgtttcgtcctcccgta

所述的核酸适配体c20-1的用途，用于活体细胞内分子成像和靶向药物传输试剂或者制品。

本发明的c20-1是一种能广谱性自主穿透多种活体细胞膜的核酸适配体，可以在实验室条件下用做活体细胞内分子成像和靶向药物传递的工具。具有核酸适配体的通用特点，如：高亲和力，高特异性，稳定性高，无毒性，免疫原性低。相比于对照核酸适配体，核酸适配体c20-1能有效进入活体细胞内；荧光标记的核酸适配体c20-1能穿透多种活体细胞如nih3t3(mouseembryonicfibroblastcellline),hff(humanforeskinfibroblast),mef(mouseembryonicfibroblasts)以及raw264.7(mouseleukaemicmonocytemacrophagecellline)。综上，c20-1能主动穿透多种活体细胞膜，将有助于开发针对活体细胞内分子成像和靶向药物传输试剂或者制品。

本发明的主要优点和有益效果：

核酸适配体不但和抗体一样能与靶分子高效、特异地结合,而且具有许多抗体无法比拟的优点,如分子量小、靶分子广泛(包括毒素、免疫原性弱和不具有免疫原性的物质)、自身稳定性强、变性复性快速可逆、免疫原性低、体外筛选不依赖动物或细胞和易进行多种修饰修与标记等。核酸适配体c20-1能主动穿透多种活体细胞膜。上述结果显示c20-1是一种新型活体细胞内分子成像和靶向药物传输的工具。本发明对于活体细胞内成像和靶向医疗具有重大意义。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为筛选到的细胞核酸适配体库的高通量测序结果。

图2为采用荧光标记的核酸适配体c20-1，对照核酸适配体d20-1和hff(humanforeskinfibroblast)孵育。

图3为采用不同细胞系和荧光标记的核酸适配体c20-1孵育。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细具体的介绍，旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

核酸适配体c20-1是采用一种基于细胞内-selex的方法，采用为具有活性的nih3t3细胞系为筛选对象。200pmol的单链dna文库(包含了10¹²～10¹⁵个不同的寡核苷酸)在缓冲液(pbs包含5mmmgcl2,0.1mg/mltrna,1mg/mlbsa)中加热到加热到95℃5分钟，然后在冰上快速降温制备。

nih3t3细胞用pbs洗三次。然后dna库加入到nih3t3细胞孵育60min，，然后细胞用pbs洗三次，除去未结合的适配体，分离得到细胞-适配体复合物；将确定与细胞结合的核酸适配体进行pcr扩增并富集纯化，筛选出能够和细胞特异性结合的核酸适配体。通过2轮重复的筛选后，第三轮筛选开始，dna适配体库先和细胞孵育60min，然后细胞用0.05％胰蛋白酶在37℃处理10分钟，收集细胞，pbs洗三次，离心(1500转/分，5分钟)，然后利用相同的方法pcr扩增，然后此方法重复两轮筛选。筛选结束后，我通过高通量测序的选择了筛选论数1，3和5。通过分析高通量测序结果，结果如图1所示，在后来的选择轮数中，尤其是在第五轮中，重复序列的百分比增加，说明通过此筛选富积了某些核酸适配体，其中c20-1是富积频率较高的候选核酸序列。

c20-1是通过dna合成仪按照它们的序列顺序合成，然后通过高效液相色谱(hplc)或者是变性电泳(ultrapage)纯化，最后通过离心浓缩干燥而制备。

优选的，为了明确筛选的核酸适配体c20-1对自主进入活体细胞内是特异 性地，而不是由于细胞的一种非选择性的吞噬。我选取了荧光标记的对照核酸适配体和活的hff细胞进行孵育，通过三次独立重复实验后，结果如图2所示，相比于对照核酸d20-1，发现荧光标记的c20-1能更自主有效地进入hff(humanforeskinfibroblast)细胞内。进一步采用fitc荧光标记的核酸适配体c20-1和不同活细胞反应(nih3t3(mouseembryonicfibroblastcellline),hff(humanforeskinfibroblast),mef(mouseembryonicfibroblasts)以及raw264.7(mouseleukaemicmonocytemacrophagecellline),经过三次独立重复试验后，结果如图3所示，核酸适配体c20-1均能自主有效地进入这些活细胞内。

结论：

1)通过细胞内selex方法可以筛选得到自主进入细胞内的核酸适配体。

2)核酸适配体c20-1自主进入细胞内是特异性地。

3)核酸适配体c20-1能进入不同的活细胞内：(nih3t3(mouseembryonicfibroblastcellline),hff(humanforeskinfibroblast),mef(mouseembryonicfibroblasts)以及raw264.7(mouseleukaemicmonocytemacrophagecellline)。