本发明涉及植物基因工程与作物育种领域，尤其是一种控制水稻纹枯病抗性的ossbr1基因及其rna干扰片段的应用。
背景技术：
：：水稻纹枯病是世界水稻三大病害之一。其病原物为立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)，属于土传腐生真菌，寄主范围广泛。纹枯病菌侵染大田水稻始于分蘖期至抽穗期，从靠近水面的叶鞘开始，也可以危害叶片、茎秆甚至稻穗。发病水稻易倒伏，不抽穗，瘪粒和空粒增多或出现白穗。轻者减产10％左右，严重的减产50％以上。目前，水稻纹枯病防控主要依靠代价高、污染大的药剂防治和效率较低的栽培管理方法，除此之外没有更有效的措施。推广抗病或耐病水稻品种被认为是防治纹枯病的理想办法。国内外研究者鉴定到一些中等抗(耐)病的水稻品种，如特青、jasmine85、镇稻1号、镇稻609、pecos和ysbr1等。更多研究表明水稻纹枯病抗性呈数量性状遗传效应，受qtl控制。目前尚未发现抗纹枯病主效基因(resistantgene，或r基因)。由于缺少抗纹枯病水稻种质材料，至今还没有高抗纹枯病水稻品种问世，纹枯病的流行态势难以被遏制。植物基础抗性在抵御腐生型病原菌侵染的过程中扮演重要角色。水稻纹枯病菌是一种主要营腐生型生活方式的病原真菌，有一种观点认为，植物种质资源中也许就不存在抵抗腐生菌的r基因。r基因的抗病作用往往是在病原菌侵染点引起植物细胞过敏性坏死，这可以限制活体型病原菌继续侵染其它健康细胞，但是对于限制腐生菌侵染的作用有限。有研究表明，在植物抗病信号传导途径中，激发hr反应的水杨酸信号(salicylicacid,sa)途径被阻断，对腐生型病原菌的抗病影响不大，而阻碍负责非生物胁迫信号传导的茉莉酸(jasmonicacid,ja)和乙烯(ethylene,et)信号途径则严重影响寄主植物对腐生菌的抗性。因此，从水稻自身免疫体系出发，通过育种或转基因技术，对基础抗性基因进行调控，激发或增强植物免疫反应，可望提高水稻纹枯病抗性。植物体内存在两种免疫机制：由病原菌相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpattern,pamp)诱导的基础免疫(pamp-triggeredimmunity,pti)以及效应因子诱导的特异免疫反应(effectortriggeredimmunity,eti)。pti是由病原微生物表面的多糖、几丁质、鞭毛蛋白等诱导的一种非特异防卫反应。pti早于eti，与eti相互补充，但又有不同。pti抗病反应比较缓慢、温和，虽然不能根除病害，但是能够延缓病情发展。pamp往往是病原物进化过程中的保守序列，通过pamp激发的pti免疫途径，在进化上也就比效应因子激发 的eti途径(对应于r基因抗性)更保守。pti是植物抵御绝大部分病原微生物的免疫机制，表现为基础抗性，具有广谱和持久抗性特点。因此，pti相关抗病基因，对于解析水稻抗纹枯病分子机理和进行育种应用，均具有重要利用价值。综上所述，虽然水稻纹枯病的防控对于水稻生产非常重要，但是，目前生产实践中尚未找到该病害的主效抗病基因，更未有高抗纹枯病水稻品种育成。鉴于pti免疫途径和基础抗病反应的重要性，通过转基因技术，研究纹枯病菌侵染过程中呈诱导表达的水稻pti相关基因，可以筛选获得具有纹枯病抗性的水稻基因。获得的水稻抗病基因，可进一步用于解析水稻抗纹枯病的分子机理，创制抗纹枯病转基因水稻，以及培育抗纹枯病水稻品种。技术实现要素：本发明目的是提供一种ossbr1基因的生物学功能，即在水稻中处于抑制表达条件下，具有对水稻纹枯病菌的抗病性。ossbr1基因在rgap(ricegenomeannotationproject)、rap-db(riceannotationprojectdatabase)中的位点分别是loc_os01g48000和os01g0670100，在水稻粳稻亚种中，该基因全长cdna在genebank中的获取号是genbank:ak101461.1，在水稻籼稻亚种中，该基因编码序列在籼稻9311的基因组数据库中的获取号是osibcd003597。一种ossbr1基因的rna干扰片段(ossbr1-rnai片段)，其核苷酸序列如seqidno：1所示。一种含有上述ossbr1基因的rna干扰片段的载体。作为优选，上述载体以pbdl03为骨架载体，包含ossbr1基因的rna干扰片段的反向插入片段和正向插入片段。所述的骨架载体pbdl03是双元载体panda(panda由pcambia1300和gateway重组系统改造而来，具体过程参见mikiandshimamoto,2004.simplernaivectorsforstableandtransientsuppressionofgenefunctioninrice.plantcellphysiol45(4):490-495的衍生载体：把p-camv35s:mcherry:tnos片段(p-camv35s指花椰菜花叶病毒35s启动子，mcherry指红色荧光蛋白，tnos指根瘤农杆菌胭脂碱合成酶的终止子)以及p-ubi:t3a片段(p-ubi指玉米泛素基因启动子，t3a指豌豆rbcs基因终止子)，克隆到双元载体pcambia1300(cambia)上的ecori和hindiii酶切位点，获得载体pbdl02；再向pbdl02中p-ubi和t3a之间的saci和kpni酶切位点，克隆来自panda的saci/kpni(attr-guslinker-attr)片段(attr指gateway重组系统的lr重组位点，guslinker指gus报告基因的1kb片段，作为rnai反向插入片段 和正向插入片段之间的内含子区)，得到载体pbdl03。水稻ossbr1基因的163bpcdna片段，被克隆到gateway重组系统的入门载体，并与pbdl03进行lr重组反应，产生ossbr1-rnai转化载体。ossbr1基因与上述rna干扰片段或载体在研究水稻纹枯病抗性的分子生物学机制中的应用。ossbr1基因及上述rna干扰片段或载体在创制抗纹枯病转基因水稻植株、培育抗纹枯病水稻品种、以及控制植物对纹枯病菌抗性中的应用。本发明利用rnai转基因技术，获得的ossbr1抗纹枯病水稻基因，可以应用于抗纹枯病转基因水稻的创制以及抗纹枯病水稻品种的培育。与未转化受体水稻品种“泰粳394”相比，ossbr1-rnai转基因植株的纹枯病抗性显著提高(2014年和2015年大田纹枯病接种试验的病级，比“泰粳394”降低0.78至1.13级，差异显著性均达到1％水平；在发病条件下，ossbr1-rnai转基因植株的农艺性状表现正常，其结实率，显著高于“泰粳394”)。本发明还证实抑制表达ossbr1基因，水稻抗病相关基因ospr1、ospr1b、pbz1、e2f-relatedgene、pdr和pr3呈超量表达，转基因植株的纹枯病抗性显著提高，这是关于水稻纹枯病抗性分子机理研究的一个新发现。附图说明图1是pbdl03载体结构示意图；图2是ossbr1-rnai载体结构示意图；图3：ossbr1-rnai转基因水稻株系ossbr1基因转录水平的qrt-pcr分析。"mcherry-"和"mcherry+"分别为ossbr1-rnai转基因水稻株系的阴性分离株和阳性分离株；引物对p1(p1-f:tccgctcctccgacaggct；p1-r:gatcatctcgtaccctggcg)和引物对p2(p2-f:tgagcggttcaagtctgtggt；p2-r:cgctgaccaatggcgacgatt)，用于特异性地扩增ossbr1表达序列的不同位点；纵轴为基因相对表达量(以ef，os03g08020为内参基因)；图4：ossbr1的抑制表达导致抗病相关基因pr1(os07g03730)、pr1b(os01g28450)、pbz1(os12g36880)、e2f-relatedgene(os03g13050)、pdr(os01g42370)和pr3(os06g51060) 超量表达(treat：接菌；mock：非接菌对照；ossbr1-rnai：ossbr1rnai转基因水稻株系；泰粳394：未转化水稻品种泰粳394)。图5：ossbr1转基因水稻株系和对照品种泰粳394发病程度的比较(2015年扬州大田纹枯病接种试验结果)。具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步说明：实施例：一、纹枯病诱导差异表达基因ossbr1的基因芯片筛选：lemont是国际公认的纹枯病感病水稻品种，ysbr1是被国家2007年公益性行业(农业)科研专项“三大作物纹枯病菌种类与寄主抗性的鉴定技术”研究协作组认可的相对抗病水稻品种。强致病力的纹枯菌yn-7菌株接种ysbr1(中抗)/lemont(感病)成株水稻，并在接种后的0h、6h、10h、20h分别取叶鞘组织，提取总rna。各总rna样品分别进行含有一万五千个着重于水稻抗病途径相关等基因的基因芯片差异表达筛选，microarray筛选交由上海博豪公司进行。基因芯片数据分析结果显示，纹枯菌接种后20h时，osrbr1在ysbr1(抗病)和lemont(感病)水稻中分别诱导上调表达3.6倍和7.4倍，如下表所示。纹枯菌诱导表达水稻基因芯片数据中ossbr1(loc_os01g48000)基因相对表达量二、ossbr1-rnai载体构建：从水稻基因组数据库(http://signal.salk.edu/cgi-bin/ricege)下载ossbr1编码序列，选取163bp特异序列作为rnai靶序列。根据靶序列设计两端分别带有bamhi和xhoi酶切位点的引物p10进行rt-pcr扩增靶序列，并构建含有靶序列的入门载体。入门载体构建完成后，通过gateway技术的lr反应将靶序列重组到rnai载体pbdl03上，如图1所示，并测序验证。三、水稻遗传转化：测序后序列分析正确的ossbr1-rnai载体转入农杆菌eha105菌株中，通过农杆菌介导进行水稻遗传转化。以农艺性状优良的主栽感病水稻品种泰粳394为转化受体，通过农杆菌侵染，转化水稻。水稻转化流程为：1)泰粳394种子去壳，消毒清洗后，置诱导培养基上培养30-35天长出愈伤组织；2)挑取淡黄色、结构紧凑的胚性愈伤组织继代培 养10-15天；3)携带转基因载体的农杆菌与待转化愈伤组织共培养三天，之后，进行选择培养，选一、选二各20天；4)选择培养40-50天后，进行分化培养。用灯式荧光检测器检测愈伤组织荧光激发情况进行初筛，镊子挑取有荧光激发的阳性转化子到分化培养基上培养；5)分化50天左右进行生根培养，15天后，炼苗并栽植。遗传转化的t0代转基因植株种植于农科院转基因作物种植基地，获的转基因水稻t1代种子。四、ossbr1-rnai转基因水稻植株ossbr1的表达量检测：将ossbr1-rnai转基因水稻株系与泰粳394发芽后种于温室，一周后分别单株水稻苗取样，利用trizol方法，提取水稻样品总rna。将rna反转录为cdna，用takara公司的sybrpremixextaq(perfectrealtimekit)，以ef(os03g08020)为内参基因进行ossbr1表达量的real-timepcr分析,如图3所示。(rna提取、cdna合成、real-timepcr反应程序体系及引物，见第“八、十、十一”)五、“微室法”苗期ossbr1-rnai转基因水稻纹枯病接种抗性鉴定(详细方法见徐国娟等，2015)：水稻种子于ms培养基上无菌发芽，种植于灭菌营养土，通过间苗和控制植株密度，使植株生长势保持一致。将长满纹枯病菌yn-7菌丝的pda琼脂块，置于秧苗基部，与茎秆相贴，用去底的可乐瓶罩住接种植株。通过可乐瓶和植物生长箱进行保温保湿，以促进纹枯病菌侵染。如下表所示：表：ossbr1受体激酶基因rnai株系的苗期抗纹枯病接种鉴定每次重复(即1个微室)设置两个处理：转基因系和泰粳394对照；每个处理接种4-5株：测量单株病斑长度和叶枕高，计算单株病级；计算转基因系和泰粳394的病级平均值，对全部数据进行成对t测验。六、ossbr1表达被抑制后水稻体内pr基因pr1(os07g03730)、pr1b(os01g28450)、pbz1(os12g36880)、e2f-relatedgene(os03g13050)、pdr(os01g42370)、pr3(os06g51060) 的表达量检测。“微室法”接种ossbr1-rnai转基因水稻和泰粳394，以未带纹枯病菌的琼脂块处理ossbr1-rnai转基因水稻和泰粳394作为mock对照。接种后20小时分别取纹枯病接种样品ossbr1-rnai-treat、泰粳394-treat，和未接种mock对照样品ossbr1-rnai-mock、泰粳394-mock。提取各样品rna进行real-timepcr检测，结果如图4所示。(rna提取、cdna合成、real-timepcr反应程序体系及引物，见第“八、十、十一”)七、ossbr1-rnai转基因水稻大田纹枯病接种抗性鉴定：采用接种效果稳定的“嵌入”法(潘学彪等，1997)，在水稻分蘖末期或孕穗期进行纹枯病接种，抽穗后30天左右按改进的rush病情分级标准进行病情调查。如下表所示：表：纹枯病菌诱导表达水稻基因rnai株系的抗纹枯病大田接种试验(2014年5-10月，扬州)鉴定了45个纹枯病菌诱导表达水稻基因的rnai转基因株系(每个水稻基因，选取1个rnai效果显著的株系；根据靶基因的qrt-pcr数据，其相对表达量为未转化对照的0.5倍以下)；对照水稻品种：ysbr1(抗病对照)，lemont(感病对照)，泰粳394(转基因受体)；比未转化对照显著抗病的转基因株系：osrbr1-rnai(ossbr1rnai转基因系)；比未转化对照显著感病的转基因株系：p082(pti相关基因的rnai系)；2014年5月3-7日发芽，t2代发芽种子经过mcherry荧光检测，筛选不分离株系；6月初移栽：3行/小区(株系)，10株/行；第1和第3行：保护行；第2行取中间8株接种；3次重复，48个小区/重复；每个重复共有45个rnai株系(45个水稻基因)、3个对照品种；分蘖末期(7月24-26日)接种：采用嵌入法，接种纹枯病菌菌系yn-7；病情调查：抽穗1个月后(10月9-12日)，评定个体病级，对48个基因型进行统计分析；字母标记表示处理之间多重比较的结果。表：纹枯病菌诱导表达水稻基因rnai株系抗纹枯病大田接种试验(2015年5-10月，扬州)八、rna提取与cdna合成：trizol试剂(invitrogen,usa)提取水稻rna，takara公司的primescripttmrtreagentkit反转录试剂盒进行cdna合成，具体操作均按说明书进行。九、pcr反应体系与程序：体系程序95℃预变性6min；95℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸20s，共30cycles；72℃延伸3min；4℃保存。在abiveritipcr仪中完成pcr反应。十、real-timepcr反应体系与程序以ef(os03g08020)为内参基因，对待测靶基因进行表达量检测，pcr反应体系如下：pcr反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40cycles；熔解曲线。在abi7900荧光定量pcr以上进行real-timepcr检测。十一、pcr与real-timepcr过程中使用的引物，如下表所示：除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。当前第1页12当前第1页12