高信噪比多探针PCRTaqman探针及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及一种高信噪比多探针PCR Taqman探针及其应用。

背景技术：

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程的定量实验技术。多探针荧光定量PCR是在同一PCR反应体系含有针对多个特异的靶序列的多对探针进行PCR反应和荧光检测。

目前荧光定量PCR采用最多的探针为Taqman探针，该探针为一寡核苷酸，探针的5'端修饰一个报告荧光基团，3'端修饰一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5'端→3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

但是由于Taqman探针的长度一般在18～45nt之间，因此淬灭基团无法完全的吸收报告基团的荧光，所以在荧光定量PCR的过程中存在一定的背景噪音。而在多重荧光定量PCR过程中，一个通道中探针个数会增加到10个甚至更多，这样会导致背景噪音的叠加，从而降低了荧光信号的信噪比，导致多重荧光定量PCR在同一荧光通道探针较多的情况时出现灵敏度降低等检测困难的现象。

中国发明专利CN200710122376.X公开了一种荧光标记的寡核苷酸探针及其应用。该发明的探针一改传统Taqman探针中把荧光报告基团和荧光淬灭基团分别放在探针两端的设计方法，把荧光淬灭基团设计在探针的中部，同时在荧光淬灭基团两端各修饰一个荧光报告基团，该发明的探针一分子探针被水解时可以释放两分子荧光，可以增强荧光信号强度，提高检测的灵敏度，但是其成本也加倍，并且背景噪音没有减弱，甚至会更强，因此开发一种高信噪比的多重荧光定量PCR Taqman探针对于提高多重荧光定量PCR的灵敏度是十分必要的。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种多探针PCR Taqman探针，其能够有效降低Taqman探针PCR尤其是多Taqman探针PCR的背景噪音，提高检测的灵敏度。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种荧光定量PCR Taqman探针，其为标记有荧光基团和淬灭基团的一段寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列至少包括一碱基T，所述淬灭基团标记在所述碱基T上，以确保淬灭基团标记的稳定性，保证淬灭效果，所述荧光基团标记在淬灭基团的上游碱基上，并且与所述淬灭基团距离8～25nt(nt为单链核苷酸)，使淬灭基团可最大程度上吸收荧光基团发射的荧光，降低荧光定量PCR背景，但荧光基团与淬灭基团的标记的距离也不能过近，当荧光基团与淬灭基团之间的距离小于8nt时，探针上荧光基团与淬灭基团标记的位置越近，荧光基团被水解释放后发射的荧光信号强度越低，影响结果检测的灵敏度。

优选的是，其中，所述寡核苷酸序列的长度为18～45nt(nt为单链核苷酸)，既保证探针与模板结合效率，又保证淬灭基团的淬灭效果。

优选的是，其中，所述荧光基团选自标记稳定且其发射荧光较易被淬灭的FAM(6-羧基荧光素)、ROX(5-羧基-X-罗丹明)、JOE(2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素)、CY3(3H-吲哚菁)、CY5(5H-吲哚菁)、TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)、VIC、NED中的任意一种。

优选的是，其中，所述淬灭基团为本身不会发射荧光的BHQ或QSY，在多探针PCR检测中，若淬灭基团本身也可发生荧光，易产生荧光交叉干扰，增加背景干扰。

优选的是，其中，所述寡核苷酸序列的3’端使用磷酸基团、氨基或封闭碱基予以封闭，防止探针在PCR扩增过程中被延伸。

优选的是，其中，当所述寡核苷酸序列的5’端为碱基G时，所述荧光基团标记于5’端以外的位置，因为5’端的碱基G有淬灭效果，且即使探针被水解成单个碱基，与荧光基团相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号，干扰对结果的判断。

优选的是，其中，在多探针荧光定量PCR反应体系中所述Taqman探针加入的浓度为0.0001～10μmol/L。

优选的是，其中，多探针荧光定量PCR反应体系的多个探针中至少有一个所述Taqman探针，以保证背景噪音的降低，提高检测灵敏度。

本发明荧光定量PCR Taqman探针可广泛应用于各种使用探针的领域，尤其适用于一个通道存在多个探针的核酸PCR检测领域，尤其适用于广谱人乳头瘤病毒(HPV)核酸的一管检测。

本发明至少包括以下有益效果：

1.本发明通过改变并缩短荧光基团和淬灭基团的标记位置，并将淬灭基团标记在探针寡核苷酸序列的碱基T上，可明显增强淬灭基团对荧光基团的抑制效率，降低背景噪音。

2.当本发明应用于多探针PCR时，可显著降低背景叠加噪音，扩大荧光信号区间，提高信噪比和检测的灵敏度，从而提高了数据的重复性，可进一步促进多探针PCR技术的发展，提高检测效率，降低反应成本。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例1中在FAM通道下分别使用不同浓度的普通探针和特殊探针进行多探针PCR检测的背景噪音对比图；

图2为本发明实施例2中分别使用特殊探针与普通探针进行多探针PCR检测的荧光信号区间的对比图；

图3为本发明实施例3中在FAM通道下分别使用普通探针组和特殊探针组进行多探针PCR检测的背景叠加噪音对比图；

图4为本发明实施例3中分别采用特殊探针组和普通探针组对9个HPV亚型同时检测的对比图。

图5为本发明实施例4中在ROX通道下分别使用普通探针组和特殊探针组进行多探针PCR检测的背景叠加噪音对比图

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

为了更好了区分本发明的高信噪比多探针PCR Taqman探针与普通Taqman探针，我们将使用了本发明的高信噪比多探针PCR Taqman探针命名为“特殊探针”组，未使用的命名为“普通探针”组。

实施例1特殊探针与普通探针PCR检测的背景噪音对比

针对同一HPV45型加入同等梯度浓度普通探针和特殊探针，探寻同等浓度下普通探针和特殊探针的背景信号强度和背景信号强度随浓度变化趋势，其中，

普通探针：FAM-5'-caagaaagacttcgcagacgtagggaacac-3'-BHQ；

特殊探针：5'-caagaaaga(FAM)cttcgcagacgt(BHQ)agggaacac-3'；

本实施例1特殊探针中，淬灭基团BHQ标记在碱基T上，荧光基团FAM标记在淬灭基团上游的碱基A上，并且距离淬灭基团BHQ 12nt。

参照图1，在同等浓度下特殊探针的背景噪音明显低于普通探针，随着探针浓度增加普通探针的背景噪音快速上升且很快达到平台期，而使用特殊探针组和特殊对比探针组的背景噪音随探针浓度增加变化趋势缓慢，且距离平台期仍有较大间距。

在本实施例中，若采用淬灭基团QSY代替淬灭基团BHQ标记在碱基T上，荧光基团FAM标记在淬灭基团上游的碱基A上，并且距离淬灭基团BHQ12nt，其效果图与图1基本一致，使用特殊探针组的背景噪音随探针浓度增加变化趋势缓慢，且距离平台期仍有较大间距。

在本实施例中，淬灭基团BHQ标记在碱基T上，采用荧光基团VIC或NED代替荧光基团FAM标记在淬灭基团上游的碱基A上，并且距离淬灭基团BHQ 12nt，其效果图与图1基本一致，使用特殊探针组的背景噪音随探针浓度增加变化趋势缓慢，且距离平台期仍有较大间距。

实施例2特殊探针与普通探针PCR检测信号区间对比

针对于同一HPV亚型加入同等浓度的特殊探针和普通探针，分别进行同等循环数的荧光定量PCR，对比PCR开始时的信号到PCR结束时的信号区间，其中针对同一HPV58型(亚型1)分别加入：

普通探针：FAM-5'-tttcaattcgatttcatgcac-3'-BHQ；

特殊探针：5'-tt(FAM)tcaattcgat(BHQ)ttcatgcac-3'；

针对同一HPV33型(亚型2)分别加入：

普通探针：TAMRA-5'-actatacacaacattgaactacagtgcgtggaatgc-3'-BHQ；

特殊探针1：5'-actatacacaacattg(TAMRA)aactacagtgcgtggaat(BHQ)gc-3'；

本实施例2的两特殊探针中，淬灭基团BHQ均标记在碱基T上，针对HPV58型特殊探针中的荧光基团FAM标记在淬灭基团上游的碱基T上，且距离淬灭基团BHQ 10nt，针对HPV33型特殊探针1中的荧光基团TAMRA标记在淬灭基团上游的碱基G上，并且距离淬灭基团BHQ 18nt。

参照图2，可以看到两组实验中，特殊探针荧光信号区间都明显大于普通探针，因此采用本发明特殊探针进行荧光定量时可以有更宽的区间进行信号检测，从而提高了信号的灵敏度。

在本实施例中，淬灭基团BHQ均标记在碱基T上，针对HPV58型特殊探针中采用荧光集团JOE代替荧光基团FAM标记在淬灭基团上游的碱基T上，且距离淬灭基团BHQ 10nt，可以达到几乎一致的优异效果，特殊探针荧光信号区间都明显大于普通探针。

针对HPV33型特殊探针1中采用荧光集团CY3代替荧光基团TAMRA标记在淬灭基团上游的碱基G上，并且距离淬灭基团BHQ 18nt，可以达到几乎一致的效果，特殊探针荧光信号区间都明显大于普通探针。

实施例3特殊探针在多探针PCR中的效果

在FAM通道中同时检测HPV31、33、39、45、51、52、56、58、66共9个HPV亚型，分别使用特殊探针组和普通探针组进行检测，其中特殊探针组中的HPV31、33、45和52四个亚型采用本发明特殊探针而其余使用普通探针进行检测，其中，HPV31、33、45和52分别对应的特殊探针为：

HPV31特殊探针：5'-catagtatt(FAM)ttgtgcaaacctacagacgccatgt(BHQ)-3'；

HPV33特殊探针：5'-actatacacaacattgaacta(FAM)cagtgcgt(BHQ)ggaatgc-3'；

HPV45特殊探针：5'-caagaa(FAM)agacttcgcagacgt(BHQ)agggaaacac-3'；

HPV52特殊探针：5'-aacacag(FAM)tgtagctaacgcacggccat(BHQ)gt-3'。

本实施例3的四个特殊探针的淬灭基团BHQ均标记在碱基T上，分别针对HPV31、HPV33、HPV45和HPV52型的特殊探针中，荧光基团FAM分别标记在淬灭基团上游的碱基T、A、A和G上，并且分别距离淬灭基团BHQ25、8、15和20nt。

参照图3，在特殊探针组中，其中9个亚型中的4个使用特殊探针后，检测图谱中整体的背景信号有明显的降低，因此证明特殊探针可有效降低多探针PCR过程中的背景叠加噪音。

参照图4特殊探针组和普通探针组对9种亚型同时检测的结果，可以看出特殊探针组的灵敏度明显高于普通探针组，且数据之间的差异性更小。

实施例4特殊探针使用不同荧光标记在多探针PCR中的效果

在ROX通道中同时检测HPV31、33、45、52、56、66共6个HPV亚型，分别使用特殊探针组和普通探针组进行检测，其中特殊探针组中的HPV31、33、45和52四个亚型采用本发明特殊探针而其余使用普通探针进行检测，其中，HPV31、33、45和52分别对应的特殊探针为：

HPV31特殊探针：5'-catagtatt(ROX)ttgtgcaaacctacagacgccatgt(BHQ)-3'；

HPV33特殊探针：5'-actatacacaacattgaacta(ROX)cagtgcgt(BHQ)ggaatgc-3'；

HPV45特殊探针：5'-caagaa(ROX)agacttcgcagacgt(BHQ)agggaaacac-3'；

HPV52特殊探针：5'-aacacag(ROX)tgtagctaacgcacggccat(BHQ)gt-3'。

本实施例4的四个特殊探针的淬灭基团BHQ均标记在碱基T上，分别针对HPV31、HPV33、HPV45和HPV52型的特殊探针中，荧光基团ROX分别标记在淬灭基团上游的碱基T、A、A和G上，并且分别距离淬灭基团BHQ25、8、15和20nt。

参照图5，在特殊探针组中，其中6个亚型中的4个使用特殊探针后，检测ROX通道图谱中整体的背景信号有明显的降低，与FAM通道结果一致，因此证明特殊探针可有效降低多探针荧光定量PCR过程中的在不同荧光通道背景叠加噪音。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明。对本发明的一种高信噪比多探针PCR Taqman探针的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

如上所述，本发明通过改变并缩短荧光基团和淬灭基团的标记位置，并将淬灭基团标记在探针寡核苷酸序列的碱基T上，可显著增强淬灭基团对荧光基团的抑制效率，降低背景噪音；同时降低成本。

当本发明应用于多探针PCR时，可明显降低背景叠加噪音，扩大信号区间，提高信噪比和检测的灵敏度，从而提高了数据的重复性，可进一步促进多探针PCR的应用，提高检测效率，降低反应成本。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。