一种荧光探针ah及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种可用于选择性检测碱性磷酸酶的荧光探 针。在细胞内常见的小分子5'磷酸核糖腺苷（简称AMP)上引入荧光团2'2羟苯基苯并噻 唑（HBT)，与碱性磷酸酶作用后，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测活细胞中 的碱性磷酸酶，并在斑马鱼的活体成像上取得良好的应用。
【背景技术】
[0002] 碱性磷酸酶（ALP，ALKP，ALPase，Alk Phos) (EC 3. 1. 3. 1)是广泛分布于人体各脏 器器官中，其中以肝脏为最多，其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。ALP能介导蛋白质，核 酸，及生物碱类等生物大分子的去磷酸化。该去磷酸化作用与激酶的磷酸化作用密切相关， 是生物体内物质代谢、物质转运、信号转导等生命活动中必要的调节过程。目前公认的碱性 磷酸酶偏高与肝脏疾病，肝肠循环，骨骼疾病密切相关。人血清的碱性磷酸酶广泛用于疾病 的指示，当ALP产生过多或排泄受阻时，均可使血中ALP水平发生变化。但是其水平调控的 内在机制并不清楚。因此，开发能够实时检测细胞中碱性磷酸酶的探针具有重要意义。
[0003] 荧光探针是有效检测生命体内碱性磷酸酶的手段之一，相比吸光度法具有检测灵 敏的优势。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应 快、选择性好、合成简单等优点。目前应用于检测碱性磷酸酶的方法主要集中于血清碱性磷 酸酶水平的检测，检测细胞中碱性磷酸酶的重要性并未受到太多重视。检测方法最广泛应 用的还是405nm下检测pnpp (磷酸对硝基酚）的去磷酸化产物的吸收光谱，检测碱性磷酸 酶的荧光探针虽然有一些新的发展，但是选择性好的荧光探针仍寥寥无几。尤其碱性磷酸 酶，酸性磷酸酶，磷酸二酯酶，腺苷酸环化酶对于去磷酸化的作用有很多底物交叉现象，开 发对其有选择性的探针具有很大挑战性。
【发明内容】
[0004] 本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内碱性磷酸酶的荧 光探针，此探针可以在生理条件下选择性地与碱性磷酸酶作用，作用后荧光显著增强。
[0005] 本发明采用如下技术方案：采用2' 2羟苯基苯并噻唑（HBT)作为荧光母体，在体 内普遍存在的小分子5'磷酸核糖腺苷（简称AMP)上引入HBT，利用反应物与产物的荧光差 别实现选择性地检测碱性磷酸酶，尤其是可以应用于检测活细胞中的碱性磷酸酶。合成的 探针化合物的结构用代号AH表示。
[0006] 所述荧光探针的结构式I如下。
[0007]
[0008] 所述的荧光探针的制备方法为：以2' 2羟苯基苯并噻唑（HBT)作为荧光母体，在 体内普遍存在的小分子5'磷酸核糖腺苷（简称AMP)上引入HBT ;具体制备步骤如下，
[0009] 1)三氯氧磷与HBT于溶剂中搅拌反应后，真空下70°C加热蒸干；
[0010] 2)步骤1)中得到的产物冷却后，加入溶剂，搅拌后，加入 2'3'-0-isopropylideneadenosine，室温下搅拌反应10h后，真空下70°C加热蒸干，再加少 量水，搅拌lh，与正丁醇共沸旋干；
[0011] 3)步骤2)中得到的产物经硅胶柱层析纯化（用二氯甲烷和甲醇做洗脱剂）得化 合物 2，3，-〇-isopropyadenosin 5，（HBT-phosphate)(白色固体）；
[0012] 4)取步骤3)所得产物溶于醋酸和水中，冷凝回流，之后与正丁醇80°C下共沸旋 干，甲醇洗涤产物三次，得到最终产物AH。
[0013] 步骤1)中所述的HBT与三氯氧磷的加入量为1 :3-10 ;步骤2)中 2' 3' -〇-isopropylideneadenosine的加入量为第一步中HBT加入量的1. 2-1. 5倍；步骤 3)中色谱法的rf为0. 1，所述的二氯甲烷与甲醇的比例为10:1 ;步骤4)中加入的醋酸和 水的量为4:1，冷凝回流的温度为KKTC，时间为2h。
[0014] 步骤1)和步骤2)中，所述的所用的溶剂为无水吡啶；步骤1)-4)中所述的搅拌 方式为磁力搅拌。
[0015] 所述的荧光探针可以用于碱性磷酸酶的定性或定量检测；所述的荧光探针和碱性 磷酸酶的作用模型符合双位点酶动力学。
[0016] 所述的荧光探针应用于检测碱性磷酸酶时，其是生成具有结构II的化合物，从而 导致荧光变化，结构II的名称为2' 2羟苯基苯并噻唑（HBT)。
[0017]
[0018] 所述的荧光探针在定量检测碱性磷酸酶中，与碱性磷酸酶作用后，512nm处检测得 的荧光强度正比于碱性磷酸酶的活性。
[0019] 所述的荧光探针可用于细胞内碱性磷酸酶的检测，实现细胞内碱性磷酸酶的荧光 成像；所述的荧光探针可用于斑马鱼体碱性磷酸酶的显色。
[0020] 本发明的有益效果：该化合物在碱性磷酸酶存在下荧光发生显著改变，可用于高 选择性、高灵敏性地检测碱性磷酸酶。尤其是，该化合物可用于细胞内中的碱性磷酸酶检 测，这对于深入研究碱性磷酸酶在生物体内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。
【附图说明】
[0021] 图1实施例1中提供的荧光探针AH的合成路线图；
[0022] 图2本发明提供的荧光探针AH检测碱性磷酸酶的原理示意图；
[0023] 图 3 本发明合成的探针 AH 的1H NMR (a)，13C NMR (b)，32P NMR (c)谱图；
[0024] 图4实施例2中荧光探针AH与荧光团HBT水溶液的紫外可见吸收光谱（a)、荧光 激发光谱（b)、发射光谱（c);
[0025] 图5实施例3中荧光探针AH对碱性磷酸酶的选择性示意图；
[0026] 图6实施例4中荧光探针AH对不同浓度的ALP响应的动力学示意图（a)及反应 速率与酶浓度的线性关系（b);
[0027] 图7实施例5中突光探针AH与碱性磷酸酶反应速率的的动力学示意图；
[0028] 图8实施例6中荧光探针AH在碱性磷酸酶被抑制作用下示意图。
[0029] 图9实施例7中荧光探针AH在Hela细胞中成像示意图。
[0030] 图10实施例8中突光探针AH在斑马鱼体活体成像示意图。
【具体实施方式】
[0031] 实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
[0032] 实施例1 (探针的合成）：
[0033] 如图1所示，AH的合成：50mL两口烧瓶真空/氮气置换三次，加入20mL的干燥 吡啶和2mL的干燥三氯氧磷，缓慢加入HBTO. 82g，室温下搅拌lh。lh后，真空下70°C加 热蒸干，得到浅绿色固体。停止加热待冷却后，重新连接真空/氮气置换三次，再次加入 批陡20mL，使润旋，使浅绿色沉淀全部溶解，加入1. 2g2'，3' -〇-Isopropylideneadenosin e (2'，3' -0-异亚丙基腺苷），搅拌，室温反应10h，10h后真空下70°C加热蒸干。再加少量 水，搅拌lh，与正丁醇共沸旋干。将所得产物经硅胶柱层析纯化（用二氯甲烷和甲醇做洗 脱剂）得化合物 2' 3' -〇-isopropyadenosin 5'（HBT-phosphate)(白色固体）质量多少 克500mg。取该化合物400mg，溶于4. 8mL醋酸和1. 2mL水中，KKTC冷凝回流2h。反应结 束后，与10mL正丁醇80°C共沸真空旋干。用甲醇洗三次，每次20mL。最终得到目标化合 物 AH(白色固体）。iHNMRGOOMHz，Dimethylsulfoxide_d6) δ (ppm) : δ = 8. 72(s，2H)，8 .61 (s, 1H), 8. 38 (d, 1H, J = 7. 72Hz), 8. 28 (s, 1H), 8. 02 (d, 1H, J = 8. 08Hz), 7. 98 (d, 1H, J =7.88Hz) ,7.70 (d，lH，J = 8. 2Hz) ,7.48 (t，lH，J = 7.32Hz) ,7.43 (t，lH，J = 7. 52Hz), 7. 35 (t, 1H, J = 7. 2Hz) , 7. 23 (t, 1H, J = 7. 48Hz) , 5. 95 (d, 1H, J = 5. 2Hz), 4. 60 (t, 1H, J = 4. 88Hz), 4. 1-4. 3 (m, 4H). 13C NMR(Dimethylsulfoxide-d6, 100MHz) δ (ppm) : 162. 82, 152. 44, 152. 06, 149. 02, 147. 86, 141. 63, 136. 00, 132. 10, 129. 20, 1 26. 63, 125. 35, 123. 94, 123. 64, 122. 93, 122. 13, 120. 62, 119. 06, 88. 00, 84. 16, 74. 35, 70. 88, 66. 48.32P NMR(Dimethylsulfoxide-d6, 100MHz) δ = 〇. 04 (s) 〇
[0034] 实施例2
[0035] 如图4所示，（荧光探针AH与荧光团HBT水溶液的紫外可见吸收光谱（a