一种荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于Cy7的荧光探针及其在检测半胱氨酸（Cys)中的应用。
【背景技术】
[0002] L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯 一具有还原性基团疏基（-SH)的氨基酸。含疏基的半胱氨酸（Cysteine, Cys)与高半胱氨 酸（Homocysteine, Hey)是同时表达在真核细胞内的含疏基的氨基酸，分子结构只有一个 亚甲基的区别，功能差异则非常明显。Cys作为人体必须的氨基酸之一，是参与蛋白质合成 的20中氨基酸中的一种，同时也是构建重要的谷胱甘肽的三个氨基酸之一，而Hey为甲硫 氨酸代谢的中间产物，本身不参与蛋白质的合成，体内高半胱氨酸含量的大小与许多疾病 相关联。现代医学研宄表明，细胞内Hey的高表达与心血管疾病及阿尔茨海默与进行性老 年痴呆有直接关联。因此，研制高选择性地识别半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光探针具有十 分重要的意义。
[0003] 正是因为半胱氨酸具有如此重要的生理和病理学意义，对存在于生物系统中的半 胱氨酸检测引起了人们的广泛重视。荧光探针是有效检测生命体内半胱氨酸的手段之一。 一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性 好、合成简单等优点。近年来，能够应用于检测活细胞中半胱氨酸的荧光探针如雨后春笋般 涌现了。在可见光区更长区段（对生物组织伤害更小）的检测半胱氨酸的荧光探针仍具有 重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种可用于选择性检测半胱氨酸的荧光探针。
[0005] 本发明采用的技术方案如下：一种荧光探针，所述的荧光探针的结构式如（I )所 示：
[0006]
[0007] 上述的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0008] 1)中间体1的合成：在N2保护下，将Cy7荧光染料、无水乙腈和甲胺水溶液混合 后，于常温下反应，TLC跟踪反应终点，将反应物过硅胶柱（200-300目的硅胶柱），干燥，得 中间体1 ;中间体1的结构如（Π )所示：
[0009]
[0010] 优选的，Cy7荧光染料与甲氨的摩尔比为1:1-1. 5 ;
[0011] TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=2-4:1。
[0012] 2)中间体2的合成：在队保护下，于冰水浴中，将硫代乙酸和2-碘乙醇混合，缓慢 滴加1，8-二氮杂二环^^一碳-7-烯（DBU)，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，TLC追 踪反应终点，反应物过硅胶柱，得中间体2 ;中间体2的结构如（III)所示：
[0013]
[0014] 优选的，硫代乙酸、DBU和2-碘乙醇的摩尔比为1-1.5:1-1.5:1 ;
[0015] TLC跟踪反应终点的展开剂为二氯甲烷。
[0016] 3)中间体3的合成：在N2保护下，于冰水浴中，将中间体1、无水二氯甲烷和三乙 胺混合，缓慢滴加三光气【双（三氯甲基）碳酸酯】的甲苯溶液，滴加完成后，将混合液置于 室温下搅拌反应，TLC追踪反应终点，至反应液由蓝色变为绿色，将反应液在真空状态下旋 干，无水乙醚洗绦，收集滤饼，得中间体3冲间体3的结构如（IV)所示：
[0017]
[0018] 优选的，中间体1、三乙胺与三光气的摩尔比为1:15-25:5-7 ;
[0019] TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=10:1。
[0020] 4)荧光探针的合成：在N2保护下，将中间体2、中间体3和三乙胺混合，于30-40°C 下反应，TLC追踪反应终点，得到目标产物荧光探针；其结构式如（I)所示。
[0021] 优选的，三乙胺、中间体2和中间体3的摩尔比为1-1.5:2-2. 5:1-1. 5。TLC跟踪 反应终点的展开剂为乙酸乙酯：甲醇=10 :1。
[0022] 本发明的荧光探针，采用Cy7作为荧光母体，在Cy7母体上引入硫酯类结构，使得 探针能够测定半胱氨酸，与半胱氨酸发生反应，指示半胱氨酸的存在或定量测定半胱氨酸 的浓度。
[0023] 本发明的荧光探针，可对半胱氨酸定性检测。应用于定性检测半胱氨酸时，其是与 半胱氨酸作用后，从而导致荧光改变；此过程可用于定性检测半胱氨酸。
[0024] 本发明的荧光探针，可对半胱氨酸定量检测。将浓度呈梯度变化的半胱氨酸的PB 缓冲液分别加入荧光探针的PB缓冲液中，反应达到平衡后，分别测定各样品的荧光强度， 然后以半胱氨酸的浓度为横坐标、反应后体系的荧光强度为纵坐标作图，即可根据荧光强 度从图中读出待测溶液中半胱氨酸的含量。此过程可用于定量检测半胱氨酸。
[0025] 本发明的荧光探针，荧光探针本身在750nm处没有荧光，与半胱氨酸作用后750nm 处荧光发生增强，且荧光强度正比于半胱氨酸浓度，从而指示半胱氨酸的存在或定量测定 半胱氨酸的浓度。因此，本发明的荧光探针，可用于定性和/或定量检测半胱氨酸。
[0026] 上述的应用，方法如下：分别将上述的荧光探针和待测物溶于PH = 5-9的磷酸 盐缓冲溶液中，分别取两种溶液，然后加入体积比为1:1的PH = 5-9磷酸盐缓冲溶液和二 甲基亚砜（DMSO)的混合液，混合均勾，得工作液，测量该工作液在Aex = 650nm，Aem = 750nm下的焚光发射光谱。
[0027] 本发明的有益效果：本发明的荧光探针，在半胱氨酸存在下荧光发生显著增强，可 用于高选择性、高灵敏性地定性及定量检测半胱氨酸。这对于深入研宄半胱氨酸在生物体 内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。
【附图说明】
[0028] 图1是实施例1合成的荧光探针的1H NMR。
[0029] 图2是实施例1合成的荧光探针的13CNMR。
[0030] 图3是实施例2中荧光探针与半胱氨酸响应后的紫外可见吸收光谱；
[0031] 其中，图3a :空白；图3b :半胱氨酸终浓度IOuM ;图3c :半胱氨酸终浓度20uM ;图 3d :半胱氨酸终浓度40uM ;图3e :半胱氨酸终浓度60uM ;图3f :半胱氨酸终浓度80uM ;图 3g :半胱氨酸终浓度100uM。
[0032] 图4是实施例2中荧光探针与半胱氨酸响应后的荧光发射光谱；
[0033] 其中，图4a :空白；图4b :半胱氨酸终浓度IOuM ;图4c :半胱氨酸终浓度20uM ;图 4d :半胱氨酸终浓度40uM ;图4e :半胱氨酸终浓度60uM ;图4f :半胱氨酸终浓度80uM ;图 4g :半胱氨酸终浓度100uM。
[0034] 图5是荧光探针与不同浓度下半胱氨酸反应速率的动力学示意图；
[0035] 其中，图5a :空白；图5b :半胱氨酸终浓度IOuM ;图5c :半胱氨酸终浓度20uM ;图 5d :半胱氨酸终浓度40uM ;图5e :半胱氨酸终浓度60uM ;图5f :半胱氨酸终浓度80uM ;图 5g :半胱氨酸终浓度100uM。
[0036] 图6是本发明荧光探针对半胱氨酸的选择性示意图；
[0037] 其中，图6a :空白；图6b :抗坏血酸；图6c :甘氨酸；图6d :组氨酸；图6e :半胱氨 酸；图6f :二硫苏糖醇；图6g :色氨酸；图6h :谷胱甘肽；图6i :谷氨酸；图6j :过氧化氢。
[0038] 图7是本发明焚光探针在不同pH下的焚光强度不意图。
[0039] 图8是本发明荧光探针对半胱氨酸的定量检测示意图。
[0040]图9是本发明荧光探针对半胱氨酸的检出限示意图。
【具体实施方式】
[0041] 以下实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
[0042] 实施例1 一种焚光探针的合成
[0043] 1)中间体1的合成：在队保护下，将Cy7-Cl (七甲川花菁）1.28g(2.0mm〇l)置于 IOOmL三口瓶中，加入50mL无水乙腈和甲胺水溶液（将0. 061g (2. Ommol)甲胺溶于20ml水 中），常温反应3小时。TLC追踪反应终点（展开剂为乙酸乙酯：甲醇=3:l(v/v))，反应 后，将反应产物过硅胶柱（硅胶的颗粒大小为200-300目的），收集流出液，真空状态下用旋 转蒸发仪旋干，得到蓝色粉末状产物lg，即中间体1，产率为79%。
[0044] 2)中间体2的合成：在队保护下，将0. 874g(ll. 5mmol)硫代乙酸置于IOOmL三口 瓶中，将三口瓶置于冰浴中，加入1.72g(10.0mmol)2-碘乙醇，再将 1.749g(11.5mmol)DBU 缓慢滴加于反应液中，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，TLC追踪反应终点（用纯二 氯甲烷作为展开剂），反应后，将反应产物过硅胶柱（硅胶的颗粒大小为200-300目的），收 集滤液，得到黄色油状液体〇. 5g，即中间体2,产率为42 %。
[0045] 3)中间体3的合成：在队保护下，将0. 127g(0. 2mmol)中间体1置于50mL三口 瓶中，加入50mL无水二氯甲烧中（必须保证绝对无水），加入0. 404g(4mmol)三乙胺，将三 口瓶置于冰浴中，将〇. 386g(l. 3mmol)固体三光气溶于2mL甲苯中，用恒压滴液漏斗缓慢的 滴加到反应液中，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，搅拌约3小时，TLC追踪反应终点 (展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=10 :1)，直至反应液由蓝色变为绿色。将反应物在 真空状态下旋干，无水乙醚60mLX 3进行洗涤，将滤饼收集，得到0. 03g绿色固体，即中间体 3,产率为22%。
[0046] 4)荧光探针的合成：在N2保护下，将0. 109g(0. 14mmol)中间体3置于IOOmL三 口瓶中，将〇. 〇34g(0. 28mmol)中间体2加入到反应瓶中，加入0. 014g(0. 14mmol)三乙胺， 35°C反应，TLC追踪反应终点（展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇=10 :1)，直至中间体3 完全反应完毕，过滤，干燥，得到0. 005g绿色的固体粉末，即为荧光探针，产率为5%。荧光 探针的结构式如（I)所示。
[0047]
[0048] 将获得的荧光探针做核磁共振氢谱图，结果如图1 :? NMR (400MHz，⑶Cl3) δ (ppm) : 7. 56-7. 48 (d，2H)，7. 43-7. 38 (t，2H)，7. 37-7. 33 (d，2H)，7. 26-7. 22 (t， 4H)，7. 19-7. 14 (d，2H)，6. 37-6. 28 (d，2H)，5. 32-5. 29 (s，2H)，4. 35-4. 29 (m， 3H)，4. 16-4. 06 (t，2H)，3. 37-3. 33 (s，2H)，3. 31-3. 04 (t，2H)，2. 89-2. 77 (m， 2H)，2. 77-2. 66 (m，2H)，2. 00-1. 96 (s，3H)，I. 67-1. 64 (s，6H)，I. 50-1. 44 (t， 6H)，I. 27-1. 24 (s，4H)，I. 00-0· 96 (t，2H)。
[0049] 将获得的荧光探针做