本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种二甲基甘氨酸脱氢酶(DMGDH)基因多态性检测用试剂体系和试剂盒及其应用。
背景技术：
：微量元素硒能提高人体免疫机能，防癌抗癌，预防心脑血管疾病，保护肝脏，抗氧化、延缓衰老，参与糖尿病的治疗，保护、修复细胞，保护眼睛，提高红细胞的携氧能力，解毒、防毒、抗污染。硒缺乏主要表现为脱发、脱甲，部分患者出现皮肤症状，少数患者可出现神经症状及牙齿损害。人轻度或中度缺硒，其症状不明显。人体缺硒会导致的疾病有：能量缺乏性营养不良，血溶性贫血，克山病，高血压，缺血性心脏病，不妊娠，糖尿病等。十二指肠是硒吸收的主要部位之一。硒由胃肠道吸收进入血液后，首先与球蛋白结合，也可结合于血浆高密度或低密度脂蛋白，进而由血浆运载进入各组织。肝、胰、肾、垂体及毛发内含硒较高，肌肉、骨胳、血液较低，脂肪组织最低。硒能够增强人体的抗癌能力和提高自身免疫力。在满足营养需要的情况下，每天补充100微克硒，对免疫功能具有显著的刺激作用，淋巴细胞和中性细胞的生成量可大量增加。这两种细胞都具有破坏肿瘤细胞的作用。根据流行病学调查，补硒对减少前列腺癌、肺癌和肝癌的发生作用最为明显。硒还能防止人体免疫力低下。在每天服200微克硒制剂的人群中，癌症总死亡率降低了50％，总发病率降低了37％。其中，前列腺癌的发病率降低了63％；结肠癌的发病率降低了58％；肺癌的发病率降低了46％。DMGDH是二甲基甘氨酸脱氢酶(dimethylglycinedehydrogenase)，可以控制肌氨酸在细胞中的水平，其缺陷或变异会导肌氨酸血症或肌氨酸尿症，且该基因在前列腺癌发生侵袭过程中扮演关键角色。rs921943是DMGDH基因上的一个单核苷酸多态性(SNP)位点，研究表明DMGDH基因的单核苷酸多态性与血硒浓度密切相关，其变异会使人血硒含量变化，影响人体新陈代谢。目前检测单核苷酸多态性的常用方法有PCR-RFLP、基因芯片，sanger测序等方法。PCR-RFLP操作复杂耗时，并且结果可信度差。PCR-RFLP扩增条件要求严格，操作繁琐。基因芯片快速高效，但其造价高。Sanger测序费用较高，且杂合体不易分型。现有技术中，尚未有能够准确、方便且特异性检测基因多态性的方法。技术实现要素：本发明解决的技术问题是：硒吸收情况难以预测，现有技术中检测基因单核苷酸多态性的方法灵敏度低、准确度低且操作不方便；尚未有能够准确、方便且特异性检测DMGDH基因单核苷酸多态性的试剂体系和试剂盒。本发明的目的是提供一种DMGDH基因单核苷酸多态性检测用试剂体系和试剂盒，通过确定单核苷酸多态性来判断硒吸收情况；利用所述试剂盒检测DMGDH基因单核苷酸多态性的灵敏度高、准确度高、特异性强，操作简单，结果直观，实用性强。具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：一方面，本发明提供了一种二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂体系，所述试剂体系包括特异性引物和限制性内切酶，所述特异性引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述限制性内切酶的酶切位点为SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间。优选的，所述限制性内切酶包括SspI酶。优选的，所述试剂体系还包括缓冲液和dNTPs，所述缓冲液的组成包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。优选的，所述试剂体系还包括DNA聚合酶，优选TaqDNA聚合酶。另一方面，本发明还提供了一种二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂盒，所述试剂盒包含前述的试剂体系。再一方面，本发明提供了特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及酶切位点为SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间的限制性内切酶在制备二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂体系或试剂盒中的应用。优选的，所述二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂体系或试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)获取样本DNA；(2)利用特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2对步骤(1)获取的样本DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)利用酶切位点为SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间的限制性内切酶与步骤(2)的扩增产物进行酶切反应；(4)将步骤(3)的反应产物进行电泳。优选的，在所述的应用中，所述限制性内切酶包括SspI酶。优选的，步骤(2)得到的扩增产物序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。优选的，步骤(3)所述的酶切反应温度为37～39℃中的任一种温度，恒温反应3～5小时。与现有技术相比，本发明的效果和益处在于：本专利采用限制性内切酶的方法检测DMGDH基因上的单核苷酸多态性，采用SspI内切酶进行酶切，准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低，操作简单方便，仪器设备要求低，适应性广。通过DMGDH基因上的单核苷酸多态性检测能够有效判断硒吸收情况。附图说明图1为实施例2的琼脂糖凝胶电泳图；其中，左起第一组条带为DNAmarker；左起第二组含有1个条带，DNA长度为408bp；左起第三组共含有3个条带，其中DNA长度分别为408bp、301bp和107bp；左起第四组共含有2个条带，其中DNA长度分别为301bp和107bp。具体实施方式目前市场上儿童补硒的产品很多，但补充硒后儿童能不能很好的吸收硒也至关重要。DMGDH基因上的一个单核苷酸多态性位点rs921943的多态性与硒吸收高度相关，通过确定rs921943位点的核苷酸序列可以有效判断硒吸收情况。本发明采用限制性内切酶法检测经处理的样本DNA中的rs921943位点的碱基序列，准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低，操作简单方便，仪器设备要求低，适应性广。本发明提供了一种二甲基甘氨酸脱氢酶(DMGDH)基因多态性检测用试剂体系和试剂盒，所述试剂体系包括特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及酶切位点在SEQIDNO.3所示序列的第301位与第302位之间的限制性内切酶，优选SspI内切酶。试剂体系中还有由三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁组成的缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶。本发明还提供了二甲基甘氨酸脱氢酶基因多态性检测用试剂或试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：(1)获取样本DNA；(2)利用特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2对步骤(1)获取的样本DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)利用限制性内切酶SspI内切酶与步骤(2)的扩增产物进行酶切反应；(4)将步骤(3)的反应产物进行电泳。在一优选实施方式中，试剂体系中的缓冲液组成为100～150mM三羟甲基氨基甲烷，400～600mM氯化钾和15～25mM氯化镁。试剂体系中的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。在另一优选实施方式中，获取样本DNA的方法为：取口腔粘膜拭子，在口腔内侧反复擦拭二十下，取出拭子折下棉絮部分，置于装有150～200μLChelex100液的1.5mL离心管中，用Chelex100液浸没标本，再加入蛋白酶K(20mg/mL)20～50μL，漩涡混匀。然后50℃水浴消化过夜，煮沸10～25min，置于冰上静置3min，以12,000r/min离心2～5min，取上清液得到样本DNA，-20℃保存待用。利用所述试剂体系中的特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2对获取得到的样本DNA进行PCR扩增，然后用限制性内切酶SspI对PCR产物进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带可以判断PCR扩增产物的第302位是A(腺嘌呤)还是G(鸟嘌呤)。若电泳仅有一个条带，说明SspI内切酶不能进行酶切，DNA双链中的第302位均为G，即扩增得到的产物序列为SEQIDNO.4，基因型为GG，硒吸收情况好；故若电泳得到两个条带，说明DNA双链均被SspI内切酶酶切成两段，DNA双链中的第302位均为A，即扩增得到的产物序列为SEQIDNO.3，基因型为AA，硒吸收情况差；若电泳得到三个条带，则说明DNA双链中的一条被SspI内切酶酶切，而另一条不能被SspI内切酶酶切，即DNA双链中的一条链中的第302位为G，另一条链中的第302位为A，PCR扩增得到的产物序列包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，基因型为AG，硒吸收情况一般。利用本发明所述试剂盒能够有效判断硒吸收情况，尤其有利于评估儿童的硒吸收情况，有助于儿童的营养补充调整，具有重要意义。本申请中对硒吸收情况的分级如下：“硒吸收情况好”是指正常饮食下不会缺硒；“硒吸收情况差”是指正常饮食下极易出现缺硒，需要额外补充硒；“硒吸收情况一般”是指正常饮食体内硒含量较正常，饮食不当时需要补充硒。采用本发明所述试剂盒检测DMGDH基因的rs921943位点单核苷酸多态性的方法简单，灵敏度高，特异性强；通过检测DMGDH基因的rs921943位点单核苷酸多态性可以确定人体的硒吸收情况，尤其是儿童的硒吸收情况。下面通过具体的实施例对本发明做进一步的说明，实施例中所用试剂和仪器的厂家如下：三羟甲基氨基甲烷，厂家：百灵威科技有限公司；氯化钾，厂家：百灵威科技有限公司；氯化镁，厂家：百灵威科技有限公司；dNTPs，厂家：TAKARA，日本；TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)，浓度为2.5U/μL，货号ET101-02-01，产品包装500U，购自TIANGEN公司，附带10×TaqBuffer；蛋白酶K，浓度为20mg/mL，货号ST533，产品包装1mL，购自Beyotime公司；Chelex100液，按照5％(w/v)的浓度配置，100Resin货号1422822，产品包装500g，购自BIO-RAD公司；SspI酶，浓度为10U/μL，货号R0132L，产品包装5000U，购自NEB公司；附带10×CutSmartbuffer；DNAmarker，50bpDNALadder，货号MD108-02，产品包装200g，购自TIANGEN公司；琼脂糖凝胶电泳仪，型号DYCP-31E，购自北京六一公司；PCR仪，型号peqSTAR95-95002，购自Peqlab公司；本发明中用到的特异性引物序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。实施例1本实施例中的试剂盒包括检测DMGDH基因单核苷酸多态性所用的特异性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，特异性引物浓度为10μm/μL；引物序列如下所示：正向引物SEQIDNO.1：AGCTGCCTTTGGATGGAGTC反向引物SEQIDNO.2：CGCTTTGCCTCTTTACCAGC本实施例中的试剂盒中还包括限制性内切酶SspI，该内切酶的浓度为10U/μL。SspI内切酶的酶切位点如下：5’-…AATATT-…3’3’-…TTA▲TAA-…5’本实施例中的试剂盒还含有缓冲液、dNTPs和TaqDNA聚合酶，其中，缓冲液的组成为150mM三羟甲基氨基甲烷，600mM氯化钾和25mM氯化镁；TaqDNA聚合酶的浓度为2.5U/μL。实施例2利用实施例1所述的试剂盒检测样本DMGDH基因rs921943位点单核苷酸多态性。本实施例对来自3个受试者的样本DNA(编号为样本1、样本2和样本3)进行平行实验，试验方法均如下所述：(1)获取样本DNA取口腔粘膜拭子，在口腔内侧反复擦拭二十下，取出拭子折下棉絮部分，置于装有150μLChelex100液的1.5mL离心管中，使标本浸没在Chelex100液中，再加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)，漩涡混匀。50℃水浴消化过夜，煮沸10min，置于冰上静置3min，以12,000r/min离心2min，取上清液得到样本DNA，-20℃保存待用。(2)PCR扩增利用表1中的PCR反应体系进行PCR扩增DMGDH基因中含有rs921943位点的基因片段。表1PCR反应体系组分用量10×buffer2.5μLdNTPs2ul(2.5mMeach)正向引物1μL(10μM)反向引物1μL(10μM)DNA样本2μLTaqDNA聚合酶0.5μLddH2OUpto25μLPCR反应条件为：人类的DMGDH基因序列在NCBI中的序列号为NC_000005.10，采用正向引物SEQIDNO.1和反向引物SEQIDNO.2进行PCR扩增后，得到的PCR产物序列如下所示：AGCTGCCTTTGGATGGAGTCATAGGCATTCCTGGAATTTTCATGGTGGAAATATTGAATTTTTGTCCATTTCTGGAGAACCTCCACGAAGATTCACAGAGACTCAAGTATTAAACGTAATGTGTTGAAGCACATCAGAAGAATTTGTTTTCTATAATATGTTTCTCCCTCTTTTTCTCACTCTCTCCTTCTCCCTCTCTTTCCCTTTTTCTCTCTCCTTCCCCTCTCTCCCCGTGTAGAGCTTCTAACTAGTAGAAACAGAATAAAATGTAATCTCTATTAAACATAAGTTATAAGACAATRTTGATTCTAGAAAATGCAGGGTCTCTTTTGGAAGAAATATTTAAAGCATAACTGTTCGATAACCAAAAACAAAACAACCCAAAAAAGCTGGTAAAGAGGCAAAGCG当第302位的R为A时，得到序列SEQIDNO.3；当第302位的R为G时，得到序列SEQIDNO.4。(3)限制性内切酶酶切按照表2中的体系进行酶切反应，反应条件为将反应液在37℃恒温箱中反应3小时。表2酶切反应体系组分用量10×CutSmartbuffer2μLPCRpruduct10μLSspI内切酶1μL(10U/μL)ddH2OUpto20μL(4)琼脂糖凝胶电泳称取琼脂糖溶解在1xTAE电泳缓冲液(Tris-乙酸缓冲液)中(用1％的凝胶)，置于微波炉上或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀。将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上，待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入1xTAE电泳缓冲液，然后拔出梳子。将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加20μL；其中，加样缓冲液的组成为0.15％溴酚蓝、0.15％二甲苯青FF、5mmol/LEDTA和15％聚蔗糖。电泳槽从左到右依次加入的是DNAmarker，经酶切反应的样本1、样本2和样本3的DNA。安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至100V，电泳1.5-2h，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色20min，水中漂洗10min，凝胶成像系统拍照保存。从凝胶电泳图可以看到，样本1与SspI内切酶反应后的产物电泳得到1个条带(电泳图中左起第2组)，DNA长度为408bp，说明产物序列中没有SspI内切酶的酶切位点，其碱基序列为SEQIDNO.4所示，基因型为GG，硒吸收好。样本2与SspI内切酶反应后的产物电泳得到3个条带(电泳图中左起第3组)，DNA长度分别为408bp、301bp和107bp，DNA条带为408bp的序列没有SspI内切酶的酶切位点，不会被切断，故保持408bp，其碱基序列为SEQIDNO.4；301bp和107bp的DNA条带是SspI内切酶酶切后的产物，说明步骤(2)PCR扩增所得产物的第302位是A，即含有5’-…AATATT-…3’序列，PCR产物的碱基序列为SEQIDNO.3；经处理的样本2的DNA的电泳结果为同时出现408bp、301bp和107bp三个条带，说明DNA双链中的一条碱基序列为SEQIDNO.3，另一条为SEQIDNO.4，基因型为AG，样本DNA提供者的硒吸收情况一般，可适当的补充含硒的产品。样本3与SspI内切酶反应后的产物电泳得到长度分别为301bp和107bp的两个条带(电泳图中左起第4组)，说明DNA双链中均含有SspI内切酶的酶切位点，基因型为AA，样本DNA提供者的硒吸收情况差，需要额外补充硒。利用本试剂盒检测得到的结果与样本提供者的硒吸收情况相符合，反映出本试剂盒检测的准确性。实施例3共12名受试者提供样本DNA，受试者的年龄在7～12岁，各受试者的样本DNA提取方法与实施例2中的步骤(1)相同。将提取得到的样本DNA依次编号为1-12，然后利用实施例1所述试剂盒按照实施例2所述的方法进行DMGDH基因多态性检测，电泳结果及硒吸收情况如表3所示。表3试剂盒检测结果利用本发明所述试剂盒检测DMGDH基因rs921943位点单核苷酸多态性得到的基因型为GG时，表示该样本DNA提供者的硒吸收情况好，正常饮食即能满足人体的硒需求；基因型为AA型时，表示该样本DNA提供者的硒吸收情况差，需要额外补充硒；基因型为AG时，表示该样本DNA提供者的硒吸收情况一般，可适当的补充硒。从表3可以看到，编号为1、2、5、7、9、和12的样本DNA对应的受试者的硒吸收情况好；编号为8、和11的样本DNA对应的受试者的硒吸收情况差；编号为3、4、6、和10的样本DNA对应的受试者的硒吸收情况一般。表3中列出的结果与12名受试者的实际硒吸收情况完全一致，充分说明本发明所述试剂盒检测DMGDH基因rs921943位点单核苷酸多态性的可靠性与特异性，同时本发明所述检测方法操作简单，实用性强。以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用于局限本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>天津脉络医学检验有限公司<120>DMGDH基因多态性检测用试剂体系和试剂盒及其应用<130>OICN160113<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1agctgcctttggatggagtc20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2cgctttgcctctttaccagc20<210>3<211>408<212>DNA<213>人工序列<400>3agctgcctttggatggagtcataggcattcctggaattttcatggtggaaatattgaatt60tttgtccatttctggagaacctccacgaagattcacagagactcaagtattaaacgtaat120gtgttgaagcacatcagaagaatttgttttctataatatgtttctccctctttttctcac180tctctccttctccctctctttccctttttctctctccttcccctctctccccgtgtagag240cttctaactagtagaaacagaataaaatgtaatctctattaaacataagttataagacaa300tattgattctagaaaatgcagggtctcttttggaagaaatatttaaagcataactgttcg360ataaccaaaaacaaaacaacccaaaaaagctggtaaagaggcaaagcg408<210>4<211>408<212>DNA<213>人工序列<400>4agctgcctttggatggagtcataggcattcctggaattttcatggtggaaatattgaatt60tttgtccatttctggagaacctccacgaagattcacagagactcaagtattaaacgtaat120gtgttgaagcacatcagaagaatttgttttctataatatgtttctccctctttttctcac180tctctccttctccctctctttccctttttctctctccttcccctctctccccgtgtagag240cttctaactagtagaaacagaataaaatgtaatctctattaaacataagttataagacaa300tgttgattctagaaaatgcagggtctcttttggaagaaatatttaaagcataactgttcg360ataaccaaaaacaaaacaacccaaaaaagctggtaaagaggcaaagcg408当前第1页1 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