一种具有抗肿瘤活性黑虎掌菌子实体多糖SAP及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性黑虎掌菌子实体多糖SAP及其制备方法和用途，属于食品加工领域。

背景技术：

恶性肿瘤极大地影响和危害人类的健康，且恶性肿瘤发病率极高，是全世界人类死亡的一个主要因素。所以，肿瘤的治疗与防治是人类面临的十分严峻的问题。随着科学与技术的发展，目前在临床上常用的治疗手段有化疗，手术切除，放射疗法等。但是在做这些治疗的同时也会带来不可逆的副作用，如杀伤正常细胞以及免疫细胞，导致机体组织与器官功能衰退，免疫功能下降等。所以，寻找一种天然的，高效的，低毒性的且能提高机体免疫功能的抗肿瘤药物是全球关注的热点也是多数研究学者的研究方向。

人们对天然抗癌药物的研究逐渐深入，真菌多糖被越来越多的人关注。自1969年，Ikekawa等人从香菇子实体中分离出抗肿瘤活性的多糖后，灵芝子实体多糖，木耳多糖，灰树花多糖，冬虫多糖等均被证明有明显的抗肿瘤活性和免疫活性。2014年张莘莘等人证明黑灵芝子实体多糖PSG-1通过活化机体免疫活性及线粒体交往通路促进肿瘤细胞凋亡。2016年，Yuting Tian等人从大杯蘑菇中分离出的多糖证明其通过线粒体通路及PI3K/Akt信号通路发挥其抗肿瘤活性。

黑虎掌菌(Sarcodon aspratus)是珍稀的野生食用菌，这种菌无盖无柄，在菌体上有纤细的茸毛，呈深褐色，并有明显的黑色花纹，形如虎爪，因而得名。菌体粗壮肥大，肉质细嫩，含有丰富的胞外多糖，营养价值极高。近期有关黑虎掌菌多糖报道在日益增长。Xiao-Qiang Han等人在虎掌菌子实体中分别提取出分子质量为4.3×10⁵Da水溶性多糖HBP以及分子质量为6.7×10⁵Da水溶性多糖HCP具有明显的免疫活性。Masashi Mizuno等人在黑虎掌菌子实体中提取出褐藻素半乳糖，激活巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF-α)和一氧化氮(NO)。而在本发明发现的虎掌菌子实体多糖(SAP)未见文献报道，并且具有很强的抗肿瘤活性是食用菌多糖中少见的。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种具有抗肿瘤活性黑虎掌菌子实体多糖SAP及其制备方法和用途。本发明发现的虎掌菌子实体多糖SAP具有很强的抗肿瘤活性，体外抗肿瘤活性检测SAP在50μg/mL时对Hela细胞的抑制率达到52.94％，对正常细胞没有毒性，且能激活免疫细胞，并且提取率为4.8％，具有重要的学术价值和广泛的商业化应用前景。

本发明具有抗肿瘤活性黑虎掌菌子实体多糖SAP，分子量为1.66×10⁶Da，其单糖组成按摩尔比为木糖:甘露糖:葡萄糖＝2.4:1:12.3。

本发明具有抗肿瘤活性黑虎掌菌子实体多糖SAP的制备方法，包括如下步骤：

1、将黑虎掌菌子实体粉碎，过60目筛，得粉料；

2、将所得粉料100g加入800mL蒸馏水中，80℃下浸提2-3h，重复浸提3-4次，合并提取液；

3、将所得提取液浓缩至100mL，加入400mL、4℃的95％乙醇至乙醇终浓度为75％，4℃静置8-12h，5000rpm/min下离心10min，弃上清，收集沉淀；

4、将步骤3得到的沉淀加蒸馏水溶解，然后加入等体积的Sevag试剂，搅拌2h，离心留取上清液，浓缩，3500Da透析袋透析去除小分子，置于-50℃、气压0.1mbar冷冻干燥机干燥48h，即可获得黑虎掌菌子实体粗多糖。

5、将步骤4获得的黑虎掌菌子实体粗多糖用蒸馏水配成20mg/mL的溶液，置于琼脂糖凝胶CL-4B层析柱，蒸馏水作为流动相，流速1.0mL/min，用苯酚-硫酸法进行检测；合并收集的多糖，置于-50℃、气压0.1mbar冷冻干燥机干燥48h，得到多糖组分SAP与SAA，苯酚-硫酸法检测多糖提取率为4.8％。

【抗肿瘤活性检测】

1、将所得多糖组分SAP与SAA分别配制成5mg/mL的溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，然后进行高效液相色谱分析其分子量。三氟乙酸降解多糖检测其单糖组成。

2、对得到的黑虎掌菌子实体多糖SAP和SAA进行体外抗肿瘤实验，分别对人宫颈癌细胞(Hela)以及人胚胎成纤维细胞(MRC-5)毒性实验。发现黑虎掌菌子实体多糖SAP对肿瘤细胞有很高的抑制活性，但对正常细胞没有毒副作用。

3、对得到的黑虎掌菌子实体多糖SAP进行体外免疫实验，结果表明：提取得到的SAP具有很高的免疫活性。

采用HPLC-ELSD检测，SAP的分子量为1.66×10⁶Da，色谱图见图1。单糖组成按摩尔比为木糖:甘露糖:葡萄糖＝2.4:1:12.3。

本发明具有抗肿瘤活性黑虎掌菌子实体多糖SAP的用途，是在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明发现虎掌菌子实体多糖SAP对肿瘤细胞具有明显的毒性作用，即使在低浓度条件下(50μg/mL)，抑制肿瘤存活率达到52.94％；免疫活性检测结果显示SAP在低浓度时(5μg/mL)即可表现出明显的刺激效应，说明SAP能增强细胞免疫活性。目前查阅资料中，尚未发现该黑虎掌菌子实体多糖的活性报道。

2、本发明方法提取的虎掌菌子实体多糖SAP高效液相色谱(HPLC)检测其分子量为1.66×10⁶Da，单糖组成按摩尔比为木糖:甘露糖:葡萄糖＝2.4:1:12.3。抗肿瘤与免疫活性强，可以为后继发展保健品或抗癌药物提取材料基础。

附图说明

图1 SAP高效液相色谱图。从图1中可以看出，高效液相色谱中样品SAP多糖的保留时间为4.6min的单一吸收峰，通过测定与计算得出SAP的分子量为1.66×10⁶Da。

图2 SAP以及SAA对肿瘤细胞的毒性检测。从图2中可以看出，SAP对肿瘤细胞的抑制作用与剂量相关。且SAP在很低的浓度，也能表现出明显的抗肿瘤活性，当达到200μg/mL时，抑制肿瘤细胞活性可达到73.66％，远优于SAA多糖。

图3 SAP对正常细胞的毒性检测。从图3中可以看出，与空白对照相比，SAP对正常细胞没有毒副作用，与低浓度五氟尿嘧啶(5-Fu)相比，说明SAP对细胞具有选择性杀伤性。

图4 SAP对肿瘤细胞凋亡检测。从图4中可以看出，阳性药物5-Fu与黑虎掌菌子实体多糖SAP作用48h之后，SAP治疗组的细胞凋亡率明显高于空白组，且细胞凋亡率从12.31％提高至24.34％。表明SAP对Hela细胞具有诱导凋亡作用，且呈剂量依赖性。

图5 SAP对巨噬细胞免疫活性的影响。从图5中可以看出，SAP对巨噬细胞具有激活作用，促进巨噬细胞释放NO，且随着SAP剂量的增加，NO分泌量增高，说明SAP能够通过增强NO的释放，激发巨噬细胞免疫能力。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1：黑虎掌菌子实体多糖SAP的制备

1、将100g黑虎掌菌子实体置于摇摆高速万能粉碎机粉碎，过60目筛，得粉料；

2、将所得粉料100g加入800mL蒸馏水中，80℃下浸提2h，重复浸提3次，合并提取液；

3、将所得提取液浓缩至100mL，加入400mL、4℃的95％乙醇至乙醇终浓度为75％，4℃静置12h，5000rpm/min下离心10min，弃上清，收集沉淀；

4、将步骤3得到的沉淀加蒸馏水溶解，然后加入等体积的Sevag试剂，搅拌2h，离心留取上清液，浓缩，3500Da透析袋透析去除小分子，置于-50℃、气压0.1mbar冷冻干燥机干燥48h，即可获得黑虎掌菌子实体粗多糖。

5、将步骤4获得的100g黑虎掌菌子实体粗多糖用蒸馏水配成20mg/mL的溶液，置于琼脂糖凝胶CL-4B层析柱，蒸馏水作为流动相，流速1.0mL/min，用苯酚-硫酸法进行检测；合并收集的多糖，置于-50℃、气压0.1mbar冷冻干燥机干燥48h后得到多糖组分SAP与SAA，苯酚-硫酸法检测多糖提取率为4.8％。

6、将所得多糖组分SAP与SAA，配制成5mg/mL的溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，然后进行高效液相色谱分析其分子量，如图1。三氟乙酸降解多糖检测其SAP多糖的单糖组成按摩尔比为木糖:甘露糖:葡萄糖＝2.4:1:12.3。

实施例2：体外抗肿瘤活性测定

1、肿瘤毒性的检测

取生长状态良好的Hela细胞，接种于96孔板，每孔加入3×10³个细胞。置于5％CO2培养液箱中适应培养24h，吸取培养板中的培养基，空白对照组加入新鲜培养基，样品处理组SAP，SAA和阳性对照组五氟尿嘧啶(5-Fu，25、50、100、200、400μg/mL)溶液，继续放入培养基中培养48h。然后除培养液，利用MTT检测样品对细胞的抑制率。对肿瘤细胞Hela的毒性结果如图2，样品处理组SAP抑制率分别为(45.81±1.48％、52.94±0.23％、63.45±1.32％、71.49±1.02％、73.66±1.30％)，SAA抑制率分别为(5.76±1.05％、7.91±1.73％、9.69±1.18％、11.52±1.38％、15.83±0.82％)，阳性对照组5-Fu抑制率分别为(75.84±1.41％、78.43±1.78％、86.01±1.61％、88.16±1.38％、90.23±1.39％)。

2、正常细胞毒性的检测

取生长状态良好的MRC-5细胞，接种于96孔板，每孔加入3×10³个细胞。置于5％CO₂培养液箱中适应培养24h，吸取培养板中的培养基，空白对照组加入新鲜培养基，样品处理组SAP(25、50、100、200、400μg/mL)与5-Fu(25μg/mL)溶液，继续放入培养基中培养48h。然后去除培养液，利用MTT检测样品对细胞的抑制率。对肿瘤细胞Hela的毒性结果见图3。

3、细胞凋亡的检测

取生长状态良好的Hela细胞，接种于6孔板，每孔加入5×10⁴个细胞，设置空白对照组，阳性对照组5-Fu(25μg/mL)，样品处理组SAP(50、100、200μg/mL)。药物处理48h后，用不含有EDTA的胰酶消化Hela细胞后，低温离心(1300rpm/min)5min后收集细胞，PBS洗涤细胞两次。按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的方法处理Hela细胞，然后进行流式细胞术检测。实验结果见图4，空白组凋亡细胞1.37％，阳性对照组34.34％，样品处理组SAP(14.31％，16.47％，24.34％)。

4、免疫活性的检测

取生长状态良好的巨噬细胞(RAW 264.7)，接种于96孔板，每孔加入2×10³个细胞适应性培养24h，设置空白对照组，阳性对照组脂多糖LPS(10μg/mL)，样品处理组SAP(5、25、50、100μg/mL)。药物处理24h后，吸取上清50μL，按照Griess法检测NO的释放水平。结果见图5，空白对照组(3.96±0.13mmol/mL)，阳性对照组脂多糖LPS(13.707±1.11mmol/mL)，样品处理组SAP(7.26±0.46、9.12±1.03、11.89±1.17、13.24±1.34mmol/mL)。