一种检测甘蔗黑顶柄锈菌的LAMP引物组及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种用于检测甘蔗褐锈病菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。具体是涉及一种用于检测引起甘蔗褐锈病的黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

甘蔗锈病是一种世界性的真菌病害，分为褐锈病(Brown rust)和黄锈病(Orange rust)2种类型，其中甘蔗褐锈病是由担子菌纲柄锈科(Pucciniaceae)柄锈菌属(Puccinia)的黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)引起的，而黄锈病则是由屈恩柄锈菌(Puccinia kuehni Butler)引起的[Ryan C C,Egan B T.Rust.//Ricaud C,Egan B T,Gillaspie Jr A G,et al,eds.Diseases of Sugarcane:Major Diseases[M].Amsterdam,the Netherlands:Elsevier,1989:189-210.]。其中甘蔗褐锈病自1950年代首次于印度报道以来[Patel M,Kamat M,Padhye Y(1950)A new record of Puccinia on sugar-cane in Bombay.Current Sci India 19:121–12]，如今该病几乎存在于世界上所有甘蔗种植区域。在1981～1982年之间，该病害曾导致墨西哥甘蔗产量损失在50％以上[Comstock JC.Effect of rust on sugarcane growth and biomass.1992.Plant Dis.,76:175–17]。比较而言，甘蔗黄锈病曾主要分布在亚洲与澳大利亚[Ryan C C,Egan B T.Rust.//Ricaud C,Egan B T,Gillaspie Jr A G,et al,eds.Diseases of Sugarcane:Major Diseases[M].Amsterdam,the Netherlands:Elsevier,1989:189-210.]，近年来该病已逐渐扩散到美国的弗罗里达州、危地马拉、哥斯达黎加、尼加拉瓜、萨尔瓦多、巴拿马、墨西哥、巴西、古巴、哥伦比亚、多米尼加、厄瓜多尔等国家和地区[Amaresh Chandra,Amber T.Keizerweerd,Michael P.Grisham.Detection of Puccinia kuehni causing sugarcane orange rust with a loop-mediated isothermal amplification-based assay[J].Mol Biotechnol,2016,58(3):188-196]。最初认为甘蔗黄锈病所导致的产量不及甘蔗褐锈病，如今随着甘蔗黄锈病的不断扩散，大有赶超之趋势。目前，2种甘蔗锈病在我国甘蔗种植区广西、云南、广东、福建、四川以及海南等均有发生，且存在混合侵染现象[傅华英，肖胜华，刘营航，等.我国甘蔗锈病病原菌及甘蔗品系抗褐锈病基因Bru1的分子检测[J].热带作物学报，2016，37(5)：958-963]。因此，生产上加强甘蔗锈病的早期检测，及时采取必要的防治措施对减少该病害的扩散传播具有重要的意义。

针对甘蔗锈菌的检测与鉴定，以往常常依赖常规的形态学并结合传统的鉴别寄主法。该方法需经过病原菌的分离(获得)—形态鉴定—回接与再分离等过程，整个过程中需要具备专业的分类学知识以及丰富的经验。即使如此，其结果的准确性和可信度易受外界因素的影响，难以满足快速、高通量鉴定与检测的实际需求。近年来随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为代表的分子检测方法得到了迅速地发展和应用。这类方法普遍具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点。目前，已建立了2种甘蔗锈病原菌特异性常规PCR检测方法[Glynn NC,Dixon LJ,Castlebury LA,et al.PCR assays for the sugarcane rust pathogens Puccinia kuehni and P.Melanocephala and detection of a SNP associated with geographical distribution in P.kuehni[J].Plant Pathology,2010,59(4):703-711.]，以及建立了甘蔗屈恩柄锈菌(Puccinia kuehnii Butler)的实时荧光定量PCR分子检测方法。然而，这些检测方法灵敏度不够高，以及需要昂贵的仪器设备，在生产第一线以及基层农技部门推广应用时受到一定限制。

LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)技术是近年新发展起来的一种新检测技术。该技术采用4条特异引物识别靶序列上6个特异区，利用DNA链置换聚合酶(BstDNA polymerase)在恒温条件下对靶基因扩增，具有便捷、快速、准确等优点。由于LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，仅需要水浴锅即可，其产物检测亦可用肉眼观察判断。目前该技术已广泛应用于包括甘蔗屈恩柄锈菌[Amaresh Chandra,Amber T.Keizerweerd,Michael P.Grisham.Detection of Puccinia kuehni causing sugarcane orange rust with a loop-mediated isothermal amplification-based assay[J].Mol Biotechnol,2016,58(3):188-196]在内的多种植物病害检测中。尽管如此，目前还未见有将LAMP检测技术应用于检测甘蔗黑顶柄锈菌的报道。因此，有必要研发一种能快速、准确检测甘蔗黑顶柄锈菌的LAMP诊断与检测技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，为了快速、简洁并准确地鉴定甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)，本发明提供一组引起甘蔗褐锈病菌的黑顶柄锈菌的特异性LAMP分子检测引物组以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的甘蔗黑顶柄锈菌的LAMP分子检测方法。

本发明的第一个方面是提供一组用于快速检测甘蔗顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的引物组，其特征在于，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。

其中，所述引物组中的外侧正向引物F3的序列如序列表中序列1所示，外侧反向引物B3的序列如序列表中序列2所示，内侧正向引物FIP的序列如序列表中序列3所示，内侧反向引物BIP的序列如序列表中序列4所示。具体地，所述引物组的序列如下：

外侧正向引物F3：CACCTGTTTGAGTGTCATG(序列表中序列1)；

外侧反向引物B3：TTAGGAGCCCTTACCCAA(序列表中序列2)；

内侧正向引物FIP：

GCTAATTACAGCAACACTCATCATCAAACCTCTCACTAAAACAACTTTG(序列表中序列3)；

内侧反向引物BIP：

TGAATAAGTTGGATTGACTTGGTGTAGATGGCAGTATTGCTACTTTC(序列表中序列4)。

本发明的第二个方面是提供一种用于快速检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP试剂盒，其包含本发明的第一个方面所述的引物组。即本发明的第二个方面的试剂盒中包含具有序列表中序列1、序列表中序列2、序列表中序列3以及序列表中序列4所示的核苷酸序列的引物组。

本发明的第三个方面是提供如第一个方面所述的引物组或本发明第二个方面所述的试剂盒在快速检测引起甘蔗褐锈病的黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)中的应用。

本发明的第四个方面是提供一种用于快速检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP方法，该方法包括使用本发明第一个方面所述的引物组或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物组进行PCR扩增的步骤。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

步骤1，从样品中提取DNA；

步骤2，用第一个方面所述的引物组或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物组进行LAMP-PCR扩增，得到扩增产物；

步骤3，通过肉眼直接观察反应液产物颜色，以及凝胶电泳检测扩增产物，从而判定样品中是否含有甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)。

本发明中，提取待测样品的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。

本发明中，将所述待测样品的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述的PCR扩增的反应体系为25μl：ddH₂O 2μl；10×Bst-DNA Polymerase Buffer 2.5μl；10mM dNTP 2.5μl；2.5μM的F3(序列1所示的核苷酸)和B3引物(序列表中序列2所示的核苷酸)各2μl；20μM的FIP(序列表中序列3所示的核苷酸)和BIP引物(序列表中序列4所示的核苷酸)各2μl；25mM Mg²⁺6μl，10M甜菜碱2μl，Bst-DNA Polymerase 1μl；20～30ng/μl的DNA模板1μl。1×Bst-DNA Polymerase Buffer：20mM Tris-HCl，10mM(NH4)₂SO₄，50mM KCl，2mM MgSO₄，0.1％(v/v)Triton X-100(pH8.8@25℃)。

所述环介导等温扩增可在60-65℃条件下进行。

所述环介导等温扩增具体可在63℃条件下进行。

本发明的引物组是根据本实验室4个自测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)菌株ITS序列于NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行同源性搜索，进而下载与其同源性较高的不同属(种)菌株ITS序列作多重比较，从而获得甘蔗黑顶柄锈菌ITS序列多态性丰富(特异性)区域，用于设计LAMP引物。

实验证明，本发明中，所述一种检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP试剂盒及其专用引物组能特异性的检测黑顶柄锈菌，而从其它供试菌株DNA中不能检测出任何条带，如甘蔗屈恩柄锈菌(Puccinia kuehnii Butler)与咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)。根据本发明的一些具体示例，本发明提供一种检测甘蔗黑顶柄锈菌的LAMP试剂盒及其专用引物组对黑顶柄锈菌的基因组DNA的最小检测量为1pg，比普通PCR检测方法的灵敏度高100倍。本检测方法具有较高的灵敏性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物组可以缩短对甘蔗黑顶柄锈菌进行鉴定的时间，较快地鉴定出甘蔗黑顶柄锈菌，从而克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。使用本发明的引物组进行检测具有灵敏度高、特异性强等特点，且本发明的检测方法具有高效、快速和敏感度高的优点，适合于大规模批量检测。

附图说明

图1为检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP反应温度条件优化结果。A为待测样品反应液颜色反应结果；B为待测样品LAMP产物凝胶电泳结果。其中B中M为DL2000marker。1为阴性H₂O对照；2为温度57℃；3为温度60℃；4为温度63℃；5为温度65℃。

图2为本发明提供的检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP引物组特异性检测结果。A为待测样品反应液颜色反应结果；B为待测样品凝胶电泳检测结果。其中M为DL2000marker。1为ddH₂O阴性对照；2～5为分离自我国不同地区的甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.；PML1、PML2、PML8、PML9；广东雷州)；6～7为咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix；HVL42，云南文山州；HVL66，云南瑞丽)；8为葡萄层锈菌(Phakopsora ampelopsidis Diet&Syd.；PAL2，海南文昌)；9为鸡蛋花鞘锈菌(Coleosporium plumierae；JML3，海南海口)；10为甘蔗屈恩柄锈菌(Puccinia kuelmii；Pk12，广东湛江)；11～12为甘蔗黑粉菌(Ustilago scitaminea；SL66、SL 67；广东湛江)；13～14为甘蔗镰形炭疽菌(Colletotrichum falcatum；SL119、120；海南澄迈)；15为甘蔗小球腔菌(Leptosphaeria sacchari；SL10，海南昌江)；16为剑麻烟草疫霉(Phytophthora nicotianae Breda；PP11，广东雷州)；17为剑麻黑曲霉菌(Aspergillus niger Van.Teigh；CH0006，广西南宁)。

图3为本发明所提供的引物组灵敏性检测结果。A为待测样品反应液颜色结果；B为待测样品产物凝胶电泳结果。其中M为DL2000marker；1，H₂O；2～3：甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)基因组模板浓度均为100ng/μL；4～5:甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度均为10ng/μL；6～7：甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度均为1ng/μL；8～9：甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度均为0.1ng/μL；10～11:甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度均为0.01ng/μL；12～13：甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度均为0.001ng/μL；14～15：甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度均为0.0001ng/μL。

图4为普通PCR检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的灵敏度结果。其中M为DL2000marker；1，H₂O；2～3：甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度为100ng/μL；4～5:甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度为10ng/μL；6～7：甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度为1ng/μL；8～9：甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度为0.1ng/μL；10～11:甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度为0.01ng/μL；12～13：甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度为0.001ng/μL；14～15：甘蔗黑顶柄锈菌基因组模板浓度为0.0001ng/μL。

图5为本发明的引物组设计的具体位置。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进步一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP组引物的制备

1、引物设计：

根据实验室测得4个引起甘蔗褐锈病的黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)菌株ITS序列与NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)甘蔗黑顶柄锈菌ITS基因序列以及其它属或种同源性ITS序列作多重比较，甘蔗黑顶柄锈菌ITS序列多态性丰富(特异性)区域。利用primer explorer 4.0软件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0)对多态性丰富或特异性区域进行引物设计。

以序列5为模板设计本发明的引物组，分别为：

F3上游引物序列：CACCTGTTTGAGTGTCATG(自序列5的5’端第44-62位核苷酸，即序列表中序列1)；

B3下游引物序列为：TTAGGAGCCCTTACCCAA(自序列5的5’端第225-242位核苷酸，即序列表中序列2)；

FIP引物序列＝F1C(自序列5的5’端第106-130位核苷酸)+F2(自序列5的5’端第64-87位核苷酸)：

GCTAATTACAGCAACACTCATCATCAAACCTCTCACTAAAACAACTTTG(序列表中序列3)；

BIP引物序列＝B1C(自序列5的5’端第156-180位核苷酸)+B2(自序列5的5’端第198-220位核苷酸的反向互补序列)

TGAATAAGTTGGATTGACTTGGTGT-AGATGGCAGTATTGCTACTTTC(序列表中序列4)。

上述引物设计的具体位置请见图5。

2、引物合成

将设计好的上游引物F3、B3、FIP以及BIP引物，委托上海立菲生物技术有限公司(广州)合成。

实施例2：LAMP检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)最佳反应温度条件筛选

利用实施例1制备所得引物组，以引起甘蔗褐锈病的黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)菌株DNA为模板，以及H₂O为阴性对照，进行LAMP-PCR扩增。

其中，PCR扩增的反应体系为25μl，具体如下：

将上述25μl LAMP反应体系迅速置于不同温度(57℃、60℃、63℃、65℃)下进行LAMP反应，反应1h后，置于85℃8min，终止反应。

通过2种方法可判断LAMP反应结果：通过肉眼直接观察待测样品反应液颜色变化，如果所述待测样品反应液呈绿色，则说明所述待测样品含有黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)；反之，反应液变为橙色，则说明待测样品不含有黑顶柄锈菌；2)将所测样品的环介导等温扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像仪下观察结果，如果观察到典型的连续梯状条带，则说明所述待测样品含有黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)；反之，则说明待测样品不含有黑顶柄锈菌。具体结果如图1。如图1A所示，待测样品反应液在4个不同温度条件下均有浅绿色至深绿色，尤以63℃反应温度较为明显。其对应产物经2％的琼脂糖凝胶分离后显示，在63℃、65℃两个温度下其梯状条带较为明显(图1B)。优选63℃为利用本发明所提供的引物组进行LAMP反应的最优温度。

实施例3：检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP引物组的特异性

利用实施例1制备所得引物组，用以下菌株验证LAMP引物组的特异性：4株甘蔗黑顶柄锈菌菌株(Puccinia melanocephala；PML1、PML2、PML8、PML9；广东雷州)，1株甘蔗屈恩柄锈菌(Puccinia kuelmii；Pk12，广东湛江)，2株咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix；HVL42，云南文山州；HVL 66，云南瑞丽)，1株葡萄层锈菌(Phakopsora ampelopsidis Diet&Syd.；PAL2，海南文昌)；1株鸡蛋花鞘锈病菌(Coleosporium plumierae；ML3，海南海口)；以及2株甘蔗黑粉菌(Ustilago scitaminea；SL66、SL 67；广东湛江)、2株甘蔗镰形炭疽菌(Colletotrichum falcatum；SL119、120；海南澄迈)、1株甘蔗小球腔菌(Leptosphaeria sacchari；SL10，海南昌江)、1株剑麻烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae Breda；PP11，广东雷州)，以及1株剑麻黑曲霉菌(Aspergillus niger Van.Teigh；CH0006，广西南宁)。上述菌株均按常规方法于上述地区采集，并鉴定。

采用真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A Fungal DNA kit,Omega公司，美国)提取上述菌株的DNA，其中，甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)、甘蔗屈恩柄锈菌(Puccinia kuelmii)、咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)、葡萄层锈菌(Phakopsora ampelopsidis Diet&Syd.)与鸡蛋花鞘锈菌(Coleosporium plumierae)直接用其夏孢子(采集已严重发锈病叶片，于实验室利用接种刀片刮下其表面附着的夏孢子堆而得到)提取DNA，其它菌株则采用菌丝体提取。

采用实施例1所述的LAMP引物组进行PCR扩增验证实验，以ddH₂O为阴性对照。

其中，PCR扩增的反应体系如下：

将上述25μl LAMP反应体系迅速置于63℃，反应1h后，置于85℃8min，终止反应。

通过2种方法可判断LAMP反应结果：通过肉眼直接观察待测样品反应颜色，如果所述待测样品反应液呈现绿色，则说明所述待测样品含有黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)；反之，待测样品反应液呈现橙色，则说明待测样品不含有黑顶柄锈菌；2)将所待测样品的环介导等温扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，如果观察到典型的连续梯状条带，则说明所述待测样品含有黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)；如果未见连续梯状条带，则说明待测样品不含有黑顶柄锈菌。具体结果如图2。试验结果与设计预期的相吻合，待测样品反应液中只有模板为甘蔗黑顶柄锈菌DNA的4个反应液中呈现出绿色，其它反应液中呈现橙色(图2中A)；其对应产物经2％的琼脂糖凝胶分离后显示，引物组仅能从模板为甘蔗黑顶柄锈菌DNA的产物中检测出典型的连续梯状条带，而从其它菌株DNA中均未检测出任何条带(图2中B)，表明引物组可特异性地检测甘蔗褐黑顶柄锈菌。

实施例4：检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的LAMP引物组灵敏性

利用实施例1制备所得引物组，通过将甘蔗黑顶柄锈菌基因组DNA浓度调整为100ng/μL，按10的数量级逐步向下稀释至10^-4ng/μL作为模板，进行LAMP-PCR扩增，以验证的LAMP引物组的灵敏性。PCR体系和反应程序与实施例2相同，PCR产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图3。如图3所示，当待测样品反应液中模板DNA浓度大于或等于0.001ng/μL时其对应反应液均呈现绿色，浓度为0.0001ng/μL以及模板为H₂O时，其反应液均呈橙色(图3A)；其对应产物经2％的琼脂糖凝胶分离后显示，引物组能从模板大于或等于0.001ng/μL的产物中检测出典型的连续梯状条带，而从浓度为0.0001ng/μL以及模板为H₂O时反应产物中检测不出任何条带(图3B)。由此表明，引物组可特异性地检测甘蔗黑顶柄锈菌基因组DNA浓度≥1pg。

实施例5：普通PCR检测甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的灵敏性结果。

利用本发明中外侧正向引物F3以及外侧反向引物B3为引物，进行普通PCR扩增，以检测对甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)的灵敏性。

其中，PCR扩增的反应体系如下：

PCR扩增的反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；12℃保存。

PCR扩增产物用质量百分比浓度为2％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳条件为135V，28min。具体结果如图4所示，当黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)DNA浓度大于或等于100pg时，利用引物对F3/B3可以特异性的扩增得到198bp的DNA条带，但当浓度小于100pg后，则扩增不到条带，由此表明，普通PCR可以检测到黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)基因组DNA浓度≥100pg。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120>检测甘蔗黑顶柄锈菌的LAMP引物组及应用

<130>WHOI170015

<160> 5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

cacctgtttg agtgtcatg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ttaggagccc ttacccaa 18

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gctaattaca gcaacactca tcatcaaacc tctcactaaa acaactttg 49

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 4

tgaataagtt ggattgactt ggtgtagatg gcagtattgc tactttc 47

<210> 5

<211> 301

<212> DNA

<213>黑顶柄锈菌（Puccinia melanocephala H. & P. Syd.）

<400> 5

aatctttgaa cgcatcttgc accttttggt attccaaaag gtacacctgt ttgagtgtca 60

tgaaaacctc tcactaaaac aactttgtta tagttttttt tagtggatga tgagtgttgc 120

tgtaattagc tcactttaaa tatataagtc tgtcttgaat aagttggatt gacttggtgt 180

aataatttga gcatcaagga aagtagcaat actgccatct tattttgggt aagggctcct 240

aacattgaac catttttaaa atgatggacc cctaacattt aagacctcaa atcaggtggg 300

a 301