检测白血病CDX2基因表达水平的引物和方法与流程

本发明涉及一种临床检验用途的基因检测方法和分子检测引物，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类白血病中的CDX2表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术：

白血病是一类造血干细胞发育异常的恶性克隆性疾病，随着我国经济的发展，环境污染的加剧及生活方式的改变，白血病的发生率呈现升高的趋势，尤其是在35岁以下中青年人群及儿童中白血病的发病率和死亡率居高不下。白血病的预后一般较差，没有较好的预防和控制措施，病死率高。目前认为，白血病微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)是白血病复发及治疗失败的根本原因。MRD作为独立的预后因素，不仅对评价化疗的疗效、监测白血病复发的意义重大，在指导危险分层后的个体化治疗中亦发挥重要作用。

尾侧型同源盒基因CDX2(caudal-related homeodomin transcription factor2,CDX2)基因是CDX基因家族的一员，作为一种原癌基因，CDX2全长共22kb，定位于13号染色体q12.13，由2个内含子和3个外显子构成，其下游表达的CDX2蛋白通过螺旋环螺旋形式与相应的DNA区域结合，共含有311个单个氨基酸，作为转录因子来调控DNA的表达。正常情况下，CDX2在胎儿期广泛表达，在整个成人期则仅在肠道腺上皮中表达。研究证实CDX2的异常表达与肠化生Barrett食管及胃癌的发生、发展及预后有关，并具有抑制结肠肿瘤的作用。CDX2并不局限于在消化道表达，在泌尿生殖、妇科、头颈部等也显示不同程度的表达。近年来的研究发现CDX2基因参与了干细胞自我更新和白血病转化，通过影响HOX基因表达调控促成白血病的发生，是与白血病发生、发展密切相关的致白血病基因，在大多数的AML、ALL患者中CDX2有不同程度的异常表达。

在实际应用中，用于检测CDX2表达的方法主要为免疫组化，尽管该法原理简单，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使我们探索新的方法来检测CDX2表达水平。

实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对PCR进行实时在线检测,反应CDX2在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间,还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR Green I染料法,双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR Green I由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于CDX2基因检测。

技术实现要素：

本发明设计了利用内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测CDX2基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，并以正常人的CDX2表达量作为参照，开发了一种新型的CDX2基因表达水平检测方法。用于白血病辅助诊断及MRD监测的检验方法，主要包括红细胞裂解液；TRIzol；氯仿；异丙醇；无水乙醇；QIAGEN RNeasy FFPE Kit。

本发明提供了一种检测CDX2基因相对表达量的引物和探针，包括：扩增覆盖CDX2基因的上下游引物CDX2-F、CDX2-R和探针CDX2-Probe，检测内参基因Abl用引物Abl-F、Abl-R和探针Abl-Probe；其碱基序列为：

CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT

CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA

CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA

Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA

Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA

Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

本发明还提供了一种检测CDX2基因相对表达量的方法，其包括如下步骤：

(1)提取血液中的总RNA；

(2)将RNA反转为cDNA；

(3)利用CDX2基因扩增的上下游引物CDX2-F、CDX2-R和探针CDX2-Probe，检测内参基因Abl用引物Abl-F、Abl-R和探针Abl-Probe对步骤(2)中的cDNA分别进行扩增；

其中检测CDX2基因的引物和探针，分别为：

CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT

CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA

CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA

检测Abl内参基因的引物和探针，分别为：

Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA

Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA

Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

进一步的，还包括阳性对照品的扩增和阴性对照品的扩增。

本发明还提供一种检测CDX2基因相对表达量的试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括CDX2基因扩增的上、下游引物CDX2-F、CDX2-R和探针CDX2-Probe，检测内参基因Abl用引物Abl-F、Abl-R和探针Abl-Probe；

其中检测CDX2基因的引物和探针，分别为：

CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT

CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA

CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA

检测Abl内参基因的引物和探针，分别为：

Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA

Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA

Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

进一步的还包括红细胞裂解液、TRIzol；氯仿；异丙醇；无水乙醇等试剂、逆转录试剂试剂及阳性对照品和阴性对照品。

本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因ABL和CDX2目的基因的定量标准曲线，检测受测者体内CDX2的相对于内参基因的表达水平。相比于以往的免疫组化方法和现今流行的△△CT法，该试剂方法和试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上白血病的早期诊断及微小残留病灶(MRD)的监测，对于及时干预治疗、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

附图说明

图1是灵敏度检测结果图。

图2是阴性样品的结果图。

图3是阳性样品的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

本发明用于辅助临床上白血病(leukemia)的早期诊断、早期预防及高危人群筛选的方法。主要包括以下试剂：红细胞裂解液；TRIzol；氯仿；异丙醇；无水乙醇；QIAGEN RNeasy FFPE Kit。

检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD qPCR MIX(TOYOBO,QPS-101)、检测目的基因用上下游引物CDX2-F，CDX2-R，探针为CDX2-Probe，检测内参基因Abl用引物为Abl-F，Abl-R，探针为Abl-Probe以及阳性对照品和阴性对照品。

其中检测CDX2基因的引物和探针，分别为：

CDX2-F:GAACCTGTGCGAGTGGAT

CDX2-R:TGATGTAGCGACTGTAGTGA

CDX2-Probe:FAM-CAGTCCCTCGGCAGCCAAGTGA-TAMRA

检测Abl内参基因的引物和探针，分别为：

Abl-F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA

Abl-R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA

Abl-Probe:FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA

阳性对照品：含CDX2基因组的溶液；

阴性对照品：不含CDX2基因组的溶液。

所述上游引物定位于该基因第一外显子，下游引物定位于第二两个外显子，探针跨越第一、第二两个外显子，对目的基因的扩增及检测具有极高的特异性；此外这段引物的PCR产物长度为146bp，片段长度小，探针法检测可得到较好的结果。

实施例2

本发明方法的操作流程：

(1)抽提血液中的总RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm 4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm 4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20ulRNase-free水溶解沉淀。

(2)参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。

(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各XμL，每人份23μL分装：

X＝23μL反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；

(4)加样：加入检测体系PCR反应液中2μL cDNA；阳性对照和阴性对照直接加2μL阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μL生理盐水或不加任何物质。

(5)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。

(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验

证；Ct＞38，为阴性。

实施例3本发明灵敏度检测

以质粒浓度为100、10、1copies/μL作为模板进行实验，每个浓度重复10次，同时设置一个空白对照。结果发现本发明的检测下线为10copies，具体见表1和图1。

表1本发明灵敏度检测结果

实施例4采用本发明所述检测方法检测健康人群标本

取待检的健康体检样品20例，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。

每份样品加入检测体系PCR反应液中2μL。同时做阳性，阴性，空白对照,内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测20份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照，检测时间仅为100分钟。20例筛查样本中所有样本的abl均起线，但CDX2未有标本出现起线。结果如表2所示，样品1的检测结果图见图2。

表2 20例健康体检样本CDX2mRNA表达水平

实施例5采用本发明所述检测方法检测临床标本

取待检的临床样品20例，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。

每份样品加入检测体系PCR反应液中2μL。同时做阳性，阴性，空白对照,内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测20份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照，检测时间仅为100分钟。20例筛查样本中所有样本的abl均起线，其中有6例出现CDX2阳性表达。实验结果如下表3所示，样品3的检测结果见图3。

表3 20例临床样本CDX2mRNA表达水平

SEQUENCE LISTING

<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司

<120> 检测白血病CDX2基因表达水平的引物和方法

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