区分动物肌肉蛋白TNNC1基因的引物及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体提供了区分动物肌肉蛋白tnnc1基因的引物及其应用。

背景技术：

动物慢肌肌钙蛋白c(troponinctype1，tnnc1)具有高度保守性，调控骨骼肌慢肌和心肌的收缩，影响肌蛋白的生成，从而可能导致动物肌肉的生长、进化和功能的差异；tnnc1基因编码的蛋白质为ctnc，是tnc家族中的一员，由161个氨基酸组成，同样的存在于骨骼肌的慢肌和心肌中。ctnc蛋白是由n-末端和c-末端的两个球形区域组成。其中c-端具有很高的亲和性，既可以与钙离子结合，也可以与镁离子结合，而n-端却具有较低的亲和性，只能够与钙离子结合，却不能与其它金属离子相结合，为钙离子特异性结合位点。

tnnc1基因是与猪肉的肉质性状密切相关的。tnnc1基因在猪的背最长肌处的表达量与肌肉水分含量、ph大小、肉色等肉质性状相关联；山羊tnnc1基因在非肌肉组织中，如肝脏和脑，其表达量很低，甚至是没有表达；而在心脏中和慢肌纤维含量高的肌肉中高表达。

tnnc1基因编码的ctnc蛋白和心肌疾病存在着重要的关系。在早期对心脏疾病的诊断中，ctnc的水平是被用来评价心肌受损程度的一种有效标志。ctnc蛋白还与一些与心血管相关的疾病有关，因而在心血管疾病的诊断方面，它也存在一定的意义，有较强的应用前景。同样的，ctnc也存在于动物的软骨中，并有抗肿瘤作用。

tnnc1基因高度保守尽管高度保守，但在不同物种之间又有特定序列的差异，通过特异的差异序列可以区分不同物种的tnnc1基因。这为生产中区分不同动物蛋白提供科学学依据。而如何将这一差异应用与生产实践中还是本领域的空白之处。

技术实现要素：

本发明的发明人针对现有技术存在的空白之处，提供了用于区分动物肌肉蛋白tnnc1基因的引物及其应用，利用本发明所提供的引物，可以以提取的动物肌肉蛋白基因为模板，借助聚合酶链式反应，从不同动物肌肉样品中扩增出大小分别为637bp和920bp的tnnc1基因片段，从而用于鉴别不同动物的肌肉蛋白，该引物及其鉴定方法具有特异性强、快速、稳定和简便的优点，适合应用于实验室和临床应用检测。

本发明的具体技术方案是：

区分动物肌肉蛋白tnnc1基因的引物，其中所采用的引物ⅰ为：

上游引物ⅰ：gaggacatcaaagctatagc，其核苷酸序列如seqidno.1所示；

下游引物ⅰ：agactcctgcaggaaagac，其核苷酸序列如seqidno.2所示；

上述引物可以从牛羊肌肉蛋白基因中扩增出大小为637bp的核酸片段。

除此之外，发明人还提供了另外一组区分动物肌肉蛋白tnnc1基因的引物，其中所采用的引物ⅱ为：

上游引物ⅱ：ttcaaggtctggagaggag，其核苷酸序列如seqidno.3所示；

下游引物ⅱ：gttaaacctggtgattgttc，其核苷酸序列如seqidno.4所示；

利用上述引物可以从狗或水貂或狐狸或貉子肌肉蛋白基因中扩增出大小为920bp的核酸片段。

上述两组引物的pcr扩增体系相同，其所对应的pcr扩增体系为：2×estaqmastermix25μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板2μl，ddh2o21μl。

引物i的pcr扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；循环30次；最后72℃，10min；4℃保存。

引物ii的pcr扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃50s；循环30次；最后72℃，10min；4℃保存。

所述的模板来源于不同发动物的肌肉组织，具体获得方法如下：

用现有技术中的常规dna提取试剂盒对牛、羊、猪、鸡、犬、水貂、狐狸、貉子的肌肉组织进行基因组的提取，用分光光度计对所提取的dna进行浓度测定，测得各物种od260/od280均在1.8-2.0之间即可用于本发明的pcr扩增。

利用上述区分动物肌肉蛋白tnnc1基因的引物可以用于鉴定肌肉蛋白来源，由于本发明所提供的引物只有在同源dna为模板的情况下能够发生pcr扩增反应，不能与非同源dna发生反应，结果表明上述核酸片段具有良好种属特异性，分别以它们为引物进行pcr扩增，检测出牛羊和犬水貂狐狸貉子的tnnc1，同时区分这些物种的肌肉蛋白，方法具有特异、稳定、快速、简便等优点，可以快速区分牛羊肉和犬水貂狐狸貉子肉，具有较高的推广利用价值。

附图说明

图1为本发明所提供引物ⅰ对不同动物pcr扩增的结果，

图中mark为dna分子量标准2000，1-8孔依次为牛、羊、猪、鸡、狗、水貂、狐狸、貉子肌肉蛋白dna模板pcr扩增结果，显示引物ⅰ可以扩增出牛羊tnnc1基因中大小为637bp的核酸条带；

图2为本发明所提供引物ⅱ对不同动物pcr扩增的结果，

图中mark为dna分子量标准2000，1-8孔依次为牛、羊、猪、鸡、狗、水貂、狐狸、貉子肌肉蛋白dna模板pcr扩增结果，显示引物ⅱ只能扩增出狗水貂狐狸貉子tnnc1基因中大小为920bp的核酸条带。

具体实施方式

下述实施例中除特殊注明外，其他均采用现有常规技术，

实施例1

区分动物肌肉蛋白tnnc1基因的引物，其中所采用的引物ⅰ为：

上游引物ⅰ：gaggacatcaaagctatagc，其核苷酸序列如seqidno.1所示；

下游引物ⅰ：agactcctgcaggaaagac，其核苷酸序列如seqidno.2所示；

上述两组引物的pcr扩增体系相同，其所对应的pcr扩增体系为：2×estaqmastermix25μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板2μl，ddh2o21μl；

pcr扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；循环30次，最后72℃，10min；4℃保存。

所述的模板来源于不同发动物的肌肉组织，具体获得方法如下：

用现有技术中的常规dna提取试剂盒(如天根生物公司提供的tianampgenomicdnakit血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒)对牛、羊、猪、鸡、犬、水貂、狐狸、貉子的肌肉组织进行基因组的提取，用分光光度计对所提取的dna进行浓度测定，测得各物种od260/od280均在1.8-2.0之间即可用于本发明的pcr扩增。

结果如图1所示，上述引物可以从牛羊肌肉蛋白基因中扩增出大小为637bp的核酸片段，但不能从猪、鸡、狗、水貂、狐狸、貉子肌肉蛋白基因中扩增出相应的核酸片段。

实施例2

区分动物肌肉蛋白tnnc1基因的引物，其中所采用的引物ⅱ：

上游引物ⅱ：ttcaaggtctggagaggag，其核苷酸序列如seqidno.3所示；

下游引物ⅱ：gttaaacctggtgattgttc，其核苷酸序列如seqidno.4所示；

上述两组引物的pcr扩增体系相同，其所对应的pcr扩增体系为：2×estaqmastermix25μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板2μl，ddh2o21μl；

pcr扩增条件为：95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，50s；循环30次，最后72℃，10min；4℃保存。

所述的模板来源于不同发动物的肌肉组织，具体获得方法如下：

用现有技术中的常规dna提取试剂盒(如天根生物公司提供的tianampgenomicdnakit血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒)对牛、羊、猪、鸡、犬、水貂、狐狸、貉子的肌肉组织进行基因组的提取，用分光光度计对所提取的dna进行浓度测定，测得各物种od260/od280均在1.8-2.0之间即可用于本发明的pcr扩增。

结果如图2所示，上述引物可以从狗或水貂或狐狸或貉子肌肉蛋白基因中扩增出大小为920bp的核酸片段，但不能从牛羊猪鸡中扩增出对应的核酸片段。

<110>山东农业大学

<120>区分动物肌肉蛋白tnnc1基因的引物及其应用

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gaggacatcaaagctatagc20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agactcctgcaggaaagac19

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttcaaggtctggagaggag19

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gttaaacctggtgattgttc20