本发明涉及一种豇豆内生真菌核酸靶序列片段的扩增技术，具体是一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌its基因扩增方法。
背景技术：
蔬菜真菌性病害约占到病害种类的80％以上，蔬菜被真菌侵染所造成的病害相当严重。真菌可通过根际土壤或风雨条件下的孢子由表皮侵入寄主，也会通过伤口等侵入，致病真菌残留于病残体、种子、土壤等越冬，遇适宜条件便可危害寄主。
豇豆作为全球范围内最重要的豆类作物之一，广泛栽培于热带亚热带地区和部分温带地区、地中海盆地和美国南部。目前全球豇豆种植面积在1250万公顷以上，年产量超过300万吨。豇豆作为我国重要的常规蔬菜品种之一，常年栽培面积超过蔬菜种植面积的10％。在豇豆生产中，由于栽培管理不当或环境条件的影响，容易造成病害流行，导致产量和品质严重受损。露地栽培的豇豆中，根腐病、锈病、煤霉病、白粉病等真菌性病害通常会对生产造成极大的影响。如何对致病真菌进行快速地定性定量检测是豇豆疾病预防与控制的关键问题。
传统的真菌性病害的检测方法主要包括洗涤镜检、保湿培养、致病性测定和pcr检测等方法。这些方法虽然可对病原微生物进行定性检测，但受到技术自身的限制，传统方法并不能一次性检测出复杂样本中所有病原微生物。因此，为了进行病原微生物的早期预防和全面筛查，植物内生微生物高通量测序技术近几年被广泛应用在植物病害检测等领域，其具有快速、可靠、分辨率高、重复性好等优点，这对于植物病害的研究提供了可重复的定量研究方法。通过高通量测序的方法，我们可对植物内生真菌(含致病真菌)的相互作用进行全面的研究。植物内生真菌是植物微生态系统中的重要组成部分，在长期协同进化过程中其与植物形成了相互依存等的关系，其产生的活性物质在植物抗病等产领域有着巨大的应用前景。但是由于真核生物its基因的高度同源性，即使采用高通量测序进行相关研究也会因为植物宿主本身基因组的干扰，造成植物内生真菌的研究处在基础研究水平。
技术实现要素：
本发明的目的在于为了克服豇豆内生真菌传统研究方法中需培养分离和豇豆基因组干扰等技术局限，提供一种新的豇豆内生真菌鉴定方法，通过本发明可通过高通量测序分类鉴定数据有针对性的选择性培养植物内生真菌，相对于传统方法，采用本发明的方法可同时研究同一样本内所有的内生真菌。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌its基因扩增方法，包括以下步骤：
1)植物预处理：取豇豆根新鲜样本0.5-1g经超声清洗后在超净台中使用有效氯浓度5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒1分钟，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70％-75％的乙醇溶液浸泡30秒，随后使用无菌水冲洗3-5遍彻底去除样本表面消毒剂；
2)植物样本总dna提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管，随后通过ctab法纯化样本总dna；
3)样本its基因的扩增：
3.1)its基因全长的乳液pcr扩增：该步骤采用的技术方案是：
a.设计2对引物nsnl和its3/its4均以真菌和豇豆its基因为模板，其中nsnl引物红色标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制豇豆基因组来源的污染，its3/its4引物对用于豇豆its基因的扩增；
b.配置豇豆内生真菌its基因的乳液pcr混合液，该混合液为乳液发生剂和pcr扩增缓冲液一；
c.将步骤b用于扩增豇豆内生真菌its基因的乳液pcr混合液移入0.2mlpcr管中并置于带有热盖功能的pcr仪中，在pcr以上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，52℃30s，68℃1min，25个循环；68℃5min，1个循环；25℃恒温；
d.向步骤c每个pcr管的反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200×g离心5分钟，离心完成后取下层水相溶液为模板进行its基因高变区/保守区扩增子扩增；
3.2)its基因高变区/保守区扩增子扩增：该步骤以3.1)中d步骤水相反应产物为模，使用its3l/its4l引物在pcr扩增缓冲液二中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的pcr循环条件下完成；
4)基于illumina平台的高通量测序及生物信息分析：
4.1)豇豆内生真菌its基因扩增子纯化回收
将3.2)步骤的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用qiaquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在250-450bp左右的目标条带，te缓冲液洗脱回收目标dna片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5v/cm，20min；
4.2)扩增子测序文库构建
文库构建使用truseqdnapcr-freesampleprepkit；
4.3)illuminahiseq测序
测序平台为illuminahiseq2500，测序模式为v2sbs快速250pe模式；
4.4)测序数据生物信息学分析
测序得到的pereads首先使用flash软件进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列等操作过程后完成数据过滤，得到可供后续分析的高质量目标序列，后续生物信息学操作使用qiime、usearch或mothur完成，统计和作图主要使用r完成，主要操作步骤如下：
a.根据barcode区分样品；
b.使用uchime去除嵌合体；
c.在97％的相似性水平上使用uparse算法进行otu聚类；
d.挑选出otu的代表性序列；
e.使用unite数据库进行物种分类信息的划分。
作为本发明进一步的方案：所述乳液发生剂由含有4.5％span80，0.4％吐温80和0.05％tritonx-100的矿物油构成。
作为本发明进一步的方案：所述pcr扩增缓冲液一由由40mmtris-hclph8.0，40mmkcl，3mmmgcl2，5％甘油，1％吐温20，1mmdntps，1个单位的koddna聚合酶、10μmnsnl-f、10μmnsnl-r和50ng的样本总dna构成。
作为本发明进一步的方案：所述pcr扩增缓冲液二由40mmtris-hclph8.0，40mmkcl，3mmmgcl2.5％甘油，1％吐温20，1mmdntps，1个单位的koddna聚合酶、10μmits3l-f、10μmits4l-r和1μl的3.1)d步骤水相反应产物构成。
作为本发明进一步的方案：所述tritonx-100纯度为色谱纯。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用高通量测序技术进行豇豆内生真菌的测序分析，相较于传统的dgge等方法数据量更大，检测结果更完整；
2、本发明采用的豇豆内生真菌测序技术最大程度降低了豇豆基因组的污染，对于豇豆内生真菌的研究带来了其他常规方法不能达到的精度和准确度；
3、本发明采用的豇豆内生真菌测序技术相较于目前采用its3-f/its4-r扩增子测序方法进行的测序，结果显示本发明的结果多样性更高，没有植物基因污染。
附图说明
图1为本发明的纲水平豇豆内生真菌群落结构高通量测序结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌its基因扩增方法，包括以下步骤：
1)植物预处理：取豇豆根新鲜样本0.5-1g经超声清洗后在超净台中使用有效氯浓度5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒1分钟，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70％-75％的乙醇溶液浸泡30秒，随后使用无菌水冲洗3-5遍彻底去除样本表面消毒剂；
2)植物样本总dna提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管，随后通过ctab法纯化样本总dna；
3)样本its基因的扩增：
3.1)its基因全长的乳液pcr扩增：该步骤采用的技术方案是：
a.设计2对引物nsnl和its3/its4均以真菌和豇豆its基因为模板，其中nsnl引物红色标记碱基为锁核酸修饰基团，nsnl引物正向序列如seqidno.1所示，nsnl引物反向序列如seqidno.2所示，用于抑制豇豆基因组来源的污染，its3/its4引物对用于豇豆its基因的扩增，its3引物如seqidno.3所示，its4引物如seqidno.4所示；
b.配置豇豆内生真菌its基因的乳液pcr混合液，该混合液为乳液发生剂和pcr扩增缓冲液一；
c.将步骤b用于扩增豇豆内生真菌its基因的乳液pcr混合液移入0.2mlpcr管中并置于带有热盖功能的pcr仪中，在pcr以上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，52℃30s，68℃1min，25个循环；68℃5min，1个循环；25℃恒温；
d.向步骤c每个pcr管的反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200×g离心5分钟，离心完成后取下层水相溶液为模板进行its基因高变区/保守区扩增子扩增；
3.2)its基因高变区/保守区扩增子扩增：该步骤以3.1)中d步骤水相反应产物为模，使用its3l/its4l引物在pcr扩增缓冲液二中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的pcr循环条件下完成；
4)基于illumina平台的高通量测序及生物信息分析：
4.1)豇豆内生真菌its基因扩增子纯化回收
将3.2)步骤的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用qiaquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在250-450bp左右的目标条带，te缓冲液洗脱回收目标dna片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5v/cm，20min；
4.2)扩增子测序文库构建
文库构建使用truseqdnapcr-freesampleprepkit；
4.3)illuminahiseq测序
测序平台为illuminahiseq2500，测序模式为v2sbs快速250pe模式；
4.4)测序数据生物信息学分析
测序得到的pereads首先使用flash软件进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列等操作过程后完成数据过滤，得到可供后续分析的高质量目标序列，后续生物信息学操作使用qiime、usearch或mothur完成，统计和作图主要使用r完成，主要操作步骤如下：
a.根据barcode区分样品；
b.使用uchime去除嵌合体；
c.在97％的相似性水平上使用uparse算法进行otu聚类；
d.挑选出otu的代表性序列；
e.使用unite数据库进行物种分类信息的划分。
优选地：所述乳液发生剂由含有4.5％span80，0.4％吐温80和0.05％tritonx-100的矿物油构成。
优选地：所述pcr扩增缓冲液一由由40mmtris-hclph8.0，40mmkcl，3mmmgcl2，5％甘油，1％吐温20，1mmdntps，1个单位的koddna聚合酶、10μmnsnl-f、10μmnsnl-r和50ng的样本总dna构成。
优选地：所述pcr扩增缓冲液二由40mmtris-hclph8.0，40mmkcl，3mmmgcl2.5％甘油，1％吐温20，1mmdntps，1个单位的koddna聚合酶、10μmits3l-f、10μmits4l-r和1μl的3.1)d步骤水相反应产物构成。
优选地：所述tritonx-100纯度为色谱纯。
采用ctab法纯化豇豆下胚轴总dna，按照前述方法进行材料预处理，随后按照本发明的方法进行豇豆内生真菌its基因片段的扩增(gsp)。同时以加入nsp-f(5'-gattgaatgatccggtgaag-3')和nlp-r(5'-gctgtcaccctctcaggc-3')引物的样本(pc)做阳性对照(该对照扩增结果为豇豆its基因)，以只使用its3-f/its4-r(未对its3l-f/its4l-r引物进行锁核酸修饰)引物对进行its片段扩增结果为阴性对照(pr)。扩增完毕后采用1％琼脂糖凝胶电泳对结果进行分离，随后将靶标pcr产物纯化回收后采用前述方法进行its高变区二次扩增后建库测序。测序结果如图1所示，阳性对照因为受到豇豆同源基因的污染，测序结果95％以上均为非目的片段，而本发明排除了豇豆基因组带来的污染，还原豇豆内生真菌的真实群落结构。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
sequencelisting
<110>申请人
<120>一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的豇豆内生真菌its基因扩增方法
<130>2017
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
gattgaatggcttagtgagg20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
ggattctcaccctctatgac20
<210>3
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
gatgaagaacgyagyraa18
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
tcctccgcttattgatatgc20