本发明属于分子检测领域,特别涉及一种检测尼曼-匹克病smpd1基因突变的试剂盒和检测方法。
背景技术:
尼曼-匹克病(niemann-pickdisease,npd)是一种常染色体隐性遗传性神经鞘磷脂沉积病,亦是一种类脂质代谢紊乱性疾病。是由于溶酶体中神经鞘磷脂酶先天缺乏而导致全身神经鞘磷脂降解代谢障碍,使得神经鞘磷脂在单核-巨噬细胞系统、神经系统和其他组织细胞中蓄积,从而出现肝、脾肿大及中枢神经系统退行性改变等。其病理特点是全身单核巨噬细胞和神经系统有大量的含神经鞘磷脂的泡沫细胞(尼曼-匹克细胞)。根据临床表现可分为5型:a型(急性神经型或婴儿型)、b型(慢性非神经型或内脏型)、c型(慢性神经型或幼年型)、d型(nova-scotia型)、e型(成人非神经型)。据报道a型约占所有npd的85%。a型与b型npd均为编码asm(acidsphingomyelinase)蛋白的smpd1(sphingomyelinphosphodiesterase1)基因发生突变所致。
a型和b型npd是因编码asm的smpd1基因发生突变而致。smpd1基因位于11号染色体p15.1–p15.4,全长5-kbp,由6个外显子构成,编码631氨基酸。npd病症表现为在肝、脾、肺、骨髓、大脑鞘磷脂的细胞内累积,引起这些器官中巨噬细胞的出现。asm缺失是罕见的,估计新生儿发病率在100000中0.4-0.6。人类asm蛋白作为75kda的糖基化多肽前体被合成,经过转化成为72kda的前体形式。该前体分为两种不同的部分。较小的部分在内质网-高尔基体复合体中裂解,形成一个57kda的形式,主要的部分则加工成70kda的成熟形式。到目前为止,已经有超过100个突变被报告引起酸性鞘磷脂酶缺失,突变类型多种多样,以点突变、小片段缺失、剪接突变多见,而点突变以碱基置换为主。在目前所发现的突变中无热点突变。
已有报道指出,smpd1编码的氨基酸第36位缬氨酸被丙氨酸取代,即p.v36a,导致asm蛋白的稳定性减弱,活性绝大部分是丧失的,从而产生asm缺乏型的npd的临床表现。p.a487v位点也由simonaro及其同事证明与npd的致病性有关;p.g508r和p.n385k虽然位于两个不同的外显子上,但可以联合对npd产生影响。目前国内关于本病的报道多是关于临床指征和实验室诊断,而有关基因突变检测的研究很少。
综上,smpd1基因突变的识别提高了npd患者的诊断准确性及治疗水平,根据临床表现、实验室检查和基因检查可对npd患者做出诊断和分型,对于疾病临床治疗及预后评估有至关重要的意义。
技术实现要素:
本发明的目的是提供一种检测smpd1基因多态突变热点的引物,采用pcr技术,可用于快速检测尼曼-匹克病患者体内smpd1基因多态位点的突变情况。所述检测smpd1基因多态热点突变情况的引物,包括:
扩增smpd1基因的引物,其碱基序列为:
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sm-e2-r:aacagctatgaccatgggtgcggcaaaacagtagaa
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进一步地,还包括测序引物,其碱基序列为:
检测smpd1基因的测序引物碱基序列为:
m13f:tgtaaaacgacggccagt
m13r:aacagctatgaccatg。
进一步地,引物序列sm-e1-f和sm-e1-r是扩增smpd1基因第1外显子序列的引物,引物序列sm-e2-f和sm-e2-r是扩增smpd1基因第2外显子序列的引物,引物序列sm-e3-f和sm-e3-r是扩增smpd1基因第3外显子序列的引物,引物序列sm-e4-f和sm-e4-r是扩增smpd1基因第4外显子序列的引物,引物序列sm-e5-f和sm-e5-r是扩增smpd1基因第5外显子序列的引物,引物序列sm-e6-f和sm-e6-r是扩增smpd1基因第6外显子序列的引物。
本发明还提供了检测smpd1基因全外显子突变情况的方法,包括以下步骤:
1.抽提血液/中的dna;
2.用pcr扩增步骤1中提取的dna;
3.对步骤2中的扩增产物进行测序;
4.对测序结果进行判断,确定smpd1基因是否发生突变;
其中pcr扩增引物为:
扩增smpd1基因的引物,其碱基序列为:
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进一步地,测序引物碱基序列为:
检测smpd1基因的测序引物碱基序列为:
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m13r:aacagctatgaccatg。
本发明还提供了一种检测smpd1基因多态突变位点的试剂盒,包括:
(i)血液dna抽提试剂;
(ii)检测体系pcr扩增反应液;
(iii)测序体系试剂;
其中pcr扩增反应液引物为:
(ⅰ)扩增smpd1基因的引物,其碱基序列为:
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sm-e2-r:aacagctatgaccatgggtgcggcaaaacagtagaa
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进一步地,测序引物碱基序列为:
m13f:tgtaaaacgacggccagt
m13r:aacagctatgaccatg。
有益效果:本发明设计了扩增smpd1全部6个外显子序列的引物。通过加接头,使所有6对引物的pcr产物均可以用一种测序引物进行测序。采用pcr技术,构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件,可使扩增效率达到最佳。smpd1基因的突变类型种类繁多且遍布整个基因,因此本发明所述引物既能将所述smpd1全外显子序列都扩增出来,测序也包括该基因全部外显子序列,也保证无论这些外显子的何处位置发生突变,都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度。荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计多个探针,成本高,检测难度大。
附图说明
图1为smpd1基因在染色体上定位图
图2为sm-e1-f/r、sm-e2-f/r、sm-e3-f/r、sm-e4-f/r、sm-e5-f/r、sm-e6-f/r的电泳图,m为markerdl2000,1-3为送检的血液样本1-3号,如图2所示,引物sm-e1-f/r、sm-e2-f/r、sm-e3-f/r、sm-e4-f/r、sm-e5-f/r、sm-e6-f/r扩增有效,且条带单一。
图3、4、5、6、7、8分别为样本1的smpd1第1、2、3、4、5、6号外显子野生型测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图,进一步阐述本发明。应当注意的是,实施例中未说明的常规条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如,奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版,或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测smpd1基因多态突变位点的引物,该引物的设计是针对smpd1全外显子设计的扩增引物,包括:
扩增smpd1基因全外显子序列的引物,其碱基序列为:
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sm-e6-r:aacagctatgaccatgaacccattagcctgtgcctc。
一种检测smpd1基因多态突变位点的试剂盒,包括
(i)血液dna抽提试剂;
(ii)检测体系pcr反应液;
(iii)测序体系试剂;
其中,组织dna抽提试剂可购自天根dna抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系pcr扩增反应液包括:2×pcrbuffer;2mmdntps;kodfxdnapolymerase(1u/μl);smpd1基因6个外显子序列的上、下游引物sm-e1-f/r、sm-e2-f/r、sm-e3-f/r、sm-e4-f/r、sm-e5-f/r、sm-e6-f/r引物浓度均为10μm。
测序体系试剂包括:测序纯化液(exoi:0.6u,cip:1.2u)、edta(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物:检测smpd1基因全外显子序列的上、下游引物分别为m13-f(3.2μm)、m13-r(3.2μm),以及bigdyeterminatorv3.1(购买自美国appliedbiosystems公司)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程:
(1)抽提血液中的组织dna:1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液,颠倒混匀,室温放置5分钟,期间再颠倒混匀几次。12,000rpm离心1min,吸去上清,留下白细胞沉淀,加200μl缓冲液ga,振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液,混匀。3)加入200μl缓冲液gb,充分颠倒混匀,70℃放置10分钟,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇,充分振荡混匀15秒,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw,12,000rpm离心30秒,倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中,12,000rpm离心2分钟,倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te,室温放置2-5分钟,12,000rpm离心2分钟,将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置:按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl,每人份19μl分装:
x=19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样:加入检测体系pcr反应液中1μldna;空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增:检测在常规pcr仪上进行,可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下:
pcr扩增体系试剂配制方法如下:
其中,引物序列为:
(5)电泳:1.5%琼脂糖凝胶电泳,110v,25min,凝胶成像系统观察。
如图2所示,即为3例血液样本以sm-e1-f/r、sm-e2-f/r、sm-e3-f/r、sm-e4-f/r、sm-e5-f/r、sm-e6-f/r引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度分别为800bp、976bp、295bp、400bp、368bp、899bp,通过电泳图的分析表明本发明所述sm-e1-f/r、sm-e2-f/r、sm-e3-f/r、sm-e4-f/r、sm-e5-f/r、sm-e6-f/r扩增有效,且条带单一。
(6)sanger测序:
取9μlpcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化:
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合:
反应程序:
沉淀环节:
向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta,静置5min;加入15μl无水乙醇,漩涡混匀;3700rpm离心30min;倒置离心15sec,加入50μl70%乙醇,漩涡混匀;3700rpm离心15min;倒置离心15sec,置于95℃金属浴上;加入10μlhi-di后进行变性试验。变性程序:
变性程序结束后,上测序仪(abi3730)测序。
(7)结果判断:分别将测序结果与smpd1野生型参考序列(genbank:nc_000011.10)进行比对,根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取3例的临床样本(样本编号为1-3)按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系pcr反应液中1μl。电泳结果如图2所示,表明本发明所述引物sm-e1-f/r、sm-e2-f/r、sm-e3-f/r、sm-e4-f/r、sm-e5-f/r、sm-e6-f/r对血液样本能有效扩增,且条带单一。
样本1的检测结果如图3、4、5、6、7、8所示:
图3显示是样本1的smpd11号外显子野生型测序截图,说明样本1的1号外显子未发生突变。
图4显示是样本1的smpd12号外显子野生型测序截图,说明样本1的2号外显子未发生突变。
图5显示是样本1的smpd13号外显子野生型测序截图,说明样本1的3号外显子未发生突变。
图6显示是样本1的smpd14号外显子野生型测序截图,说明样本1的4号外显子未发生突变。
图7显示是样本1的smpd15号外显子野生型测序截图,说明样本1的5号外显子未发生突变。
图8显示是样本1的smpd16号外显子野生型测序截图,说明样本1的6号外显子未发生突变。
从检测结果可以看出,本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了,能够扩展出smpd1基因全部6个外显子,并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出smpd1基因全外显子,无论是野生型还是突变型。
sequencelisting
<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120>一种检测尼曼-匹克病smpd1基因突变的试剂盒
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