一种牛卷毛基因快速筛选的引物、方法及试剂盒与流程

本发明属于畜牧业技术领域，尤其涉及一种牛卷毛基因快速筛选的引物、方法及试剂盒。

背景技术：

皮肤组织是动物自我保护免受外物侵扰机体的一道天然屏障，皮肤的形成促使了毛囊的发生发育，而毛发是由皮肤组织中毛囊所产生的角质化产物。毛发纤维的形成受毛囊表皮细胞和间质细胞的相互作用调控，并且只在毛发生长周期的初期发生，而在退行期停止，最后在休止期静止。毛发的表型特征包括毛发的长度、密度、形状及颜色则会随着动物机体的不同部位表现出不同的特征。不同物种，或同一物种不同种属其被毛表型差异较大，具体表现在毛发的色泽、长度、细度、密度、品质、形态结构(卷曲与否)等等。

毛发形态中的卷曲状况通常可利用直毛(straight hair)、卷毛(curly hair)和波浪形卷毛(wavy hair)词语进行描述。由于种属差异，动物被毛的分子调控机制也较为复杂，不同基因或信号分子都可能会调控这一表型性状。波浪形毛发以围绕于副皮质巨原纤维周围的正皮质和仲皮质巨原纤维间的相互交织为特征，随着毛发卷曲程度的增加，仲皮质就会消失，并形成正皮质细胞。

KRT是keratin intermediate filament的缩写形式，又可写为KRT-IF(角蛋白中间丝蛋白)，是角蛋白家族的重要成员，是形成毛发、角和指甲的主要成分。角蛋白是多种氨基酸聚成的多聚长链物，其一级结构分为主链和侧链，主链通过肽键连结构成的多缩氨酸链，侧链由20多种不同α氮基酸构成；各链的半胱氨酸中SH氧化形成二硫键，使肽键之间形成稳定交互网络，侧链的种类和性质决定了角蛋白整体的物理和化学性质。角蛋白分子间作用形式随R基的不同而异，主要有氢键、盐式键和二硫键，其中以二硫键为主要作用形式[Eckhart L,2008]。KRT-IF有I型(酸性)和II型(碱性)两种类型，KRT27基因属于I型基因。I型KRT-IF基因含有4～5kb个碱基对，有8个外显子。对猫的KRT71基因进行测序发现，存在一个600BP的特异单倍型与猫的卷毛性状显著性相关[Barbara Gandolfi,2012]。在雷克斯小鼠中，KRT71基因剪切位点的一个7bp的缺失，能够导致小鼠毛发成波浪状卷曲[Takashi KURAMOTO,2010]。在人上，KRT71基因外显子1处存在c.422T>G的杂合突变，导致编码氨基酸赖氨酸突变为天冬酰胺，最终使人患常染色体显性绵毛症(Autosomal-dominant woolly hair,ADWH)[Yutaka Shimomura,2010]。

养牛业实际生产中，卷曲毛发的牛更易寄生蜱虫及其他寄生虫，从而导致牛的生长发育迟缓，产奶量和繁殖性能下降等，影响其经济效益。因此，能够早期、快速、准确的鉴定犊牛成年后的毛发卷曲情况，从而有针对性的选择牛只，对实际生产具有指导意义。同时毛发卷曲作为一种表型信息，是一种可利用的遗传标记，通过分子手段并且结合系谱分析开发一个简单、快速、可靠性强的检测携带者试剂盒，对于牛分子育种来说具有实践意义。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了提供一种牛卷毛基因快速筛选的引物、方法及试剂盒。

为了实现上述目的，采用如下技术方案：

一种牛卷毛基因快速筛选的引物，以KRT27基因g.41636961C>G位点突变为检测对象而设计的上游引物KRT27F序列为：SEQ ID NO.1，下游引物KRT27R序列为：SEQ ID NO.2。

一种牛卷毛基因快速筛选的方法，包括使用上述引物的步骤。

一种牛卷毛基因快速筛选的方法，其步骤如下：DNA提取：采用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA；PCR扩增反应：使用上述的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；扩增产物用Takara限制酶AvaII进行酶切，然后进行凝胶电泳检测；判断结果。

所述的判断结果具体为：酶切后凝胶检测酶切DNA片段为469bp的待测牛为无卷毛基因牛；酶切后DNA片段为195bp、274bp和469bp的检测牛为卷毛基因杂合子牛。

优选：所述PCR扩增反应采用25μl PCR扩增反应体系为：模板DNA(100ng/μl)1μl，上游引物KRT27F、下游引物KRT27R各(10μmol/L)0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，用双蒸水(ddH₂O)补至25μl；

PCR扩增反应条件为:94℃变性4min；然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，这一步共35个循环；72℃保持10min；10℃保存。

优选：所述酶切反应采用30μl AvaII酶切反应体系为：PCR扩增产物10μl；Buffer 2μl；Takara限制酶AvaII1μl；ddH₂O 17μl，酶切反应条件为：30℃消化60min。

优选：酶切片段用质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳。

一种牛卷毛基因快速筛选的试剂盒，包括以KRT27基因g.41636961C>G位点突变为检测对象而设计的上游引物KRT27F序列为：SEQ ID NO.1，下游引物KRT27R序列为：SEQ ID NO.2，Taq PCR MasterMix，Takara限制酶AvaII，Takara缓冲液。

优选：一种牛卷毛基因快速筛选的试剂盒：上下游引物KRT27F和下游引物KRT27R(10μmol/L)；2×Taq PCR MasterMix；U/μL TakaraAvaII；10×Takara缓冲液；ddH₂O；2000bp DNA Ladder Marker。

其中2×Taq PCR MasterMix(含染料)是由Taq DNA Polymerase(0.05units/μl)、MgCl₂(4mM)、dNTPs(0.4mM)构成。

本发明的有益效果：

本发明的发明人对荷斯坦牛、西门塔尔牛、南阳牛、新疆褐牛、鲁西黄牛共计5个品种48个个体的KRT27基因第1外显子进行扩增后测序，共发现4处SNP，分别为g.41637129C>T、g.41637058G>C、g.41637074G>C、g.41636961C>G。将测序序列所得SNPs及单倍型组合与卷毛表型进行关联分析，发现g.41636961C>G位点只在西门塔尔牛中出现，且与卷毛表型一一对应。

本发明根据角蛋白中间丝蛋白KRT27基因(NCBI参考序列AC_000176)g.41636961C>G位点突变，产生了AvaII限制性酶切位点的原理，从而建立起筛查牛卷毛基因携带者的PCR-RFLP方法。通过分析后设计针对含有突变位点的引物，特异性扩增出469bp的牛KRT27基因含有上述位点的片段，再经限制性内切酶AvaII酶切，扩增片段中不含有AvaII酶切位点的为无卷毛基因牛(CC型)，经凝胶电泳后产生DNA片段为469bp；含有一个AvaII酶切位点的为卷毛基因杂合子牛(GC型)，经凝胶电泳后产生DNA片段为195bp、274bp、469bp。

本发明筛查方法操作简单、快捷、费用低廉、可靠性高。同时根据筛查方法开发出相应地检测试剂盒，使操作更加简单化、快速、灵敏、可靠性强，一般生产中常规实验室都有条件完成，这一发明可以对牛只毛发卷曲情况进行早期鉴定，降低寄生虫患病几率，预防寄生虫传染病，从而提高养殖经济效益。同时毛发表型一种明显的表型性状，可作为分子标记，对牛育种提供指导。

附图说明

图1是本发明的实施例1的PCR产物扩增的1％琼脂糖凝胶电泳图；

图2是不同PCR退火温度下，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是本发明的实施例1的KRT27基因分型的2％琼脂糖凝胶电泳图，其中，1：Maker，2：无卷毛基因牛，3：卷毛基因牛，4：卷毛基因牛，5：无卷毛基因牛，6：Maker；

图4是本发明的实施例2的无卷毛基因牛KRT27基因测序图；

图5是本发明的实施例2的卷毛基因携带牛KRT27基因测序图；

图6是卷毛基因携带牛的表型性状图；

图7是无卷毛基因牛的表型性状图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1.1采用酚-氯仿抽提法从牛血液中提取基因组DNA，DNA样品被稀释成50ng/μL备用。实验牛共75头，包括阿勒泰白头牛18头，南阳牛20头，新疆褐牛17头，鲁西黄牛20头。

1.2根据Genbank登录号为AC_000176.1(41631641..41637275)的KRT27的基因序列，使用Primer Premier5.0软件设计特异性引物，用于扩增牛KRT27基因片段。KRT基因外显子1共计443bp，设计引物时应注意扩增片段长度大于443bp，引物长度为15-30bp，GC含量为40％-60％，Tm在55-80℃之间，同时避开产物的二级结构区。综上所述，设计用于KRT基因扩增专用引物一对，扩增产物长度469bp，引物长度20bp，前引物GC含量55％，后引物GC含量50％，Tm值60度，无产物二级结构，特异性良好，可用于KRT27基因扩增。

所设计引物序列为：

KRT27F上游引物序列为：SEQ ID NO.1：

5'-GAGCGTGCGCTTTTCTTCTG-3'

KRT27R下游引物序列为：SEQ ID NO.2：

5'-TAAACCTCACGGCACTGTGT-3'

1.3 Tm值确定

退火温度(Tm)为引物和模板结合时候的温度参数，它是影响PCR特异性的重要因素。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。所设计的KRT27扩增引物的Tm值为56℃，需要对其进行Tm值摸索，以便找到最佳温度，既能保证目的序列有效退火，又减少非特异性结合。采用温度梯度法，分别设置Tm值为54℃、56℃、60℃、62℃、64℃、66℃，进行PCR扩增后，产物进行凝胶电泳检测。电泳结果显示，Tm值54-60℃时，出现扩增条带，其中60℃时，扩增产物条带最为明亮清晰，温度超过60℃，PCR不能扩增成功(图2)。故选择60℃为KRT27扩增引物退火温度。

1.4根据上述设计的检测牛卷毛基因携带者的引物，利用以下步骤扩增牛KRT27基因片段，扩增的片段用质量浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。

(1)使用25μl的PCR反应体系:DNA模板(60ng/μl)1μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，ddH₂O4.5μl。

(2)PCR反应条件：94℃变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，这一步共35个循环；72℃保持10min；10℃保存。

(3)扩增产物的电泳检测：5μlPCR扩增产物，加入loading buffer 5μl，混合后进行电泳检测。检测结果为，1-6个泳道为牛DNA样品检测结果，均扩增出单一的条带，大小为469bp，与目的的片段大小一致。

1.5对PCR产物的直接测序：经过测序比对发现，KRT27基因第1外显子处存在3处SNP，分别为：g.41637129C>T、g.41637058G>C、g.41636961C>G。

1.6基因分型：基因分型结果如下表1所示。

表1.牛KRT27基因g.41637129C>T分型结果

表2.牛KRT27基因g.41637058G>C分型结果

表3.牛KRT27基因g.41636961C>G分型结果

1.7 SNP位点与卷毛表型进行关联分析

对所得SNP位点及其组合单倍型与卷毛表型进行关联分析，未能发现与卷毛表型一一对应的SNP位点及单倍型。

实施例2

2.1采用酚-氯仿抽提法从23头西门塔尔牛的血液中提取基因组DNA。利用Primer Premier5.0软件设计特异性引物，用于扩增牛KRT27基因片段，所用的引物序列为：

上游引物序列为：SEQ ID NO.1：

5'-GAGCGTGCGCTTTTCTTCTG-3'

下游引物序列为：SEQ ID NO.2：

5'-TAAACCTCACGGCACTGTGT-3'

2.2根据上述设计的检测牛卷毛基因携带者的引物，利用以下步骤扩增牛KRT27基因片段，扩增的片段用质量浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(1)采用25μl的PCR反应体系:DNA(100ng/μl)1μl，上，下游引物(10μmol/L)各0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，用双蒸水(ddH₂O)补至25μl。

(2)PCR反应条件：94℃变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，这一步共35个循环；72℃保持10min；4℃保存。

(3)扩增产物的电泳检测：5μlPCR扩增产物，加上loading buffer，混合后进行电泳检测。检测结果为，1-6个泳道为牛DNA样品检测结果，均扩增出单一的条带，大小为469bp，与预期的片段大小一致。

2.3利用扩增的PCR产物直接测序。对扩增的23头西门塔尔牛的KRT27基因进行测序发现，存在一处SNP(g.41636961C>G)，仅存在于西门塔尔牛中。

2.4基因型与表型关联分析：对扩增的西门塔尔牛KRT基因的SNP位点g.41636961C>G进行直接测序后，与卷毛表型进行关联分析发现：16头牛的KRT27基因片段测序的峰图为单峰，且扩增片段的第274位碱基为C，表明KRT27基因型是CC型(图4)，对应个体表型为无卷毛牛(图7)；7头牛的KRT27基因片段测序的峰图第274位碱基测序峰图为套峰，测序碱基为C，表明KRT27基因型是GC型(图5)，对应个体表型为卷毛牛(图6)。g.41636961C>G位点基因型与个体表型一一对应。基因分型及表型关联分析结果如下表3所示。

表3.西门塔尔牛g.41636961C>G分型结果

2.5 PCR产物酶切分型

(1)选择合适限制性内切酶

对KRT27基因扩增片274bp处存在突变g.41636961C>G进行分析，发现突变导致扩增片段274-278bp处的核苷酸序列由CGACC突变为GGACC。使用生物学软件Primer Premier5.0对该处突变进行预测，发现Takara限制酶AvaII(识别序列GGTCC)可特异性识别该位点，且酶切位点单一，内切酶的产物的粘端与平端可以互相连接。

(2)酶切反应体系

对PCR扩增产物进行酶切，选用合适的反应体系，如反应体系浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。本方法采用30μl酶切，PCR扩增产物10μl；Buffer 2μl；Takara限制酶AvaII 1μl；ddH₂O 17μl。30℃，酶切60min。

(3)凝胶电泳检测

用质量浓度为2％凝胶对酶切后DNA 15μl进行电泳检测；电压100V；时间30min。

2.6酶切分型及结果分析。共对23头西门塔尔牛的PCR扩增产物进行酶切分型发现，有16头牛酶切后凝胶检测DNA片段为469bp，为无卷毛基因牛；7头牛酶切后DNA片段为195bp、274bp和469bp，为卷毛牛(图3)。

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。