一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记及其鉴定方法与流程

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记及其鉴定方法。

背景技术：

香蕉是位于水稻、小麦、玉米之后的世界第四粮食作物，也是仅次于柑桔的第二大宗水果，更是世界水果贸易量最大宗的鲜果。香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害，也是重要的检疫性病害。1967年以来，我国在台湾首次发现香蕉枯萎病4号小种之后，扩散到澳大利亚、非洲和部分亚洲国家，引起国内外普遍关注。在国内广东、广西、福建、海南、云南等主要香蕉产区也陆续发现枯萎病，并成为香蕉产业发展的主要障碍(游春平等，2008，华中农业大学学报，27(3):363-366)。香蕉枯萎病是一种土传病害，通过化学防治和农业防治都不能有效地防控此病。种植香蕉抗枯萎病品种是有效的途径，同时也不会增加栽培成本。因此，香蕉抗枯萎病新品种选育是当前香蕉产业中重要的环节。

目前生产上应用的栽培蕉多数为三倍体(2n＝3x＝33)，具有单性结果，多倍性、高度不育、没有种子等特性，这为香蕉的常规杂交育种带来了极大的困难，抗病育种就更困难了。目前香蕉新品种选育途径主要是田间变异、组织培养变异利用、化学诱变等，但由于变异率较低，其中有用的变异率更低，筛选需要的人力物力大，选育周期长，效率低，这就造成了香蕉品种更新慢，病虫害高发的现状。

随着当今生物技术的迅速发展，包括分子标记辅助育种技术、基因工程育种技术、基因组测序技术等在许多植物育种中得到了广泛的应用，并取得了显著成效。香蕉的生物技术研究起步相对较晚，进展缓慢，在香蕉抗枯萎病分子生物技术方面，也只有少量研究，研究者从不同的香蕉抗枯萎病(4号小种)材料中，获得了多个抗病基因类似物(RGAS)，并进行了分析(孟祥春，2007，分子植物育种，S1:57-60；徐金刚，2008，生物技术通报，S1：200-209；陈雅平，2007，植物生理与分子生物学学报，06：567-573)。谢江辉(2008)等公开了两对引物，主要应用于“威廉斯”香蕉的芽变植株的抗病性鉴定。香蕉的枯萎病抗病机理较为复杂，抗病相关的基因很多，目前能够直接有效的用于香蕉育种中分子手段还比较少，因此急需加快香蕉的抗病生物育种技术开发。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的之一在于提供种一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记；

本发明的目的之二是提供了所述SCAR分子标记鉴定香蕉枯萎病的方法；

本发明的目的之三是提供了所述鉴定的范围。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记，该标记来源于SRAP分子标记me6-em1扩增的一条829bp的特异条带,其序列序列为：

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所述鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记，条带长度为324bp，从原特异条带的第216bp至第539bp。

所述SCAR标记可以准确鉴定香牙蕉品种对香蕉枯萎病的抗性。

用所述SCAR分子标记鉴定香蕉枯萎病的方法：

(1)、提取香蕉叶片DNA；

(2)、用SCAR标记的特异引物SC1/SC2进行PCR扩增检测；

(3)、检测：结果表现为324bp特异条带的有无；有特异条带扩增即对香蕉枯萎抗性为感病，未有条带扩增，即对香蕉枯萎抗性为抗病。

其中，所述用SCAR标记的特异引物SC1/SC2序列为：

正向引物SC1：5’-CTCGCCGACACCTTACTTGA-3’

反向引物SC2：5’-AGGAGAGTCCAGCTCCAGTT-3’。

较佳地，所述扩增方法为：

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸7min。

PCR体系：25μl的反应体积含有10×buffer(含Mg²⁺)2.5ul，0.2mmol/L dNTPs(2.5nM)2ul，上下引物(10umol/L)分别1ul，DNA(50ng/L)1ul及1.5U TaqDNA聚合酶。

较佳地，所检测方法为：采用1.2％的琼脂糖凝胶，110v电压电泳25分钟，紫外灯下观察。

本发明利用SRAP分子标记技术，筛选出香蕉枯萎病感病品种特有的条带，根据该条带的序列，设计特异性引物，进行特异性扩增，转化成SCAR分子标记。用于鉴定香牙蕉品种的香蕉枯萎病抗感病性，为香蕉抗病新品种选育提供分子辅助技术，进一步可用于以香蕉组培苗、香蕉田间变异株系以及化学诱变后代等为筛选群体的香蕉新品种(系)的辅助筛选。其中，SCAR(sequence characterized amplified regions特定序列扩增)标记通常是由RAPD、SRAP、SSR标记转化而来。一般表现为扩增片断的有无，是一种显性标记，当扩增区域内部发生少数碱基的插入、缺失、重复等变异时，表现为共显性遗传的特点。具有方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高等优点。

本发明与传统的盆栽接种鉴定、水培接种鉴定、病地种植鉴定相比具有以下优点：可以在香蕉的任何生长期进行鉴定、周期短、操作简单、稳定性，重复性好、鉴定的是香蕉基因的变异，遗传稳定性好、不受环境影响。

附图说明

图1：引物me6-em1对16个香牙蕉样品的PCR扩增。M：2000bp marker：1-8，13号样品(抗病品种)：东蕉1号、G6-2、BXM51、农科1号、抗枯1号、南天黄、南天青、粤科1号、科2；9-12，14-16号样品(感病品种)：WS2、L1N2、L3-3、G20-5、巴西蕉、G30、NK4-1。

图2：引物SC1-SC2扩增条件优化。M：2000bp marker：1-10号样品分别为：巴西、NK、G30、L3-3、WS2、南天青、东蕉1号、农科一号、粤科1号、抗枯1号。

图3：引物SC1-SC2对抗感病香蕉品种的扩增。M：2000bp marker：1-24号样品分别为：索马里香蕉、天宝矮蕉、威廉斯、龙州中把、粗把香牙蕉、G6-2、粤科1号、农科1号、抗枯5号、漳选8-1、广东2号、东莞高把香蕉、齐尾、红河矮蕉、浦北矮蕉、墨西哥香蕉、东莞中把香蕉、河口高把香蕉、荷兰香蕉、北大矮、那龙中把香蕉、南天黄、BXM51、科2。

图4：序列比对结果。

具体的实施方式

通过以下实例进一步对本发明进行了说明与定义而并非限制。通过实例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果。下述实例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。

一、香蕉叶片的DNA提取

选取香蕉枯萎病抗性不同的香牙蕉(基因型为AAA)品种(表1)，分别进行DNA提取。

DNA提取方法采用改良CTAB法，具体操作如下：

1、香蕉的DNA提取，采用香蕉的叶片，选取没有病虫害的新抽出的嫩叶，用水冲洗干净，晾干后取0.2克，用液氮进行研磨，研磨的过程中加入少量交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，将叶片快速研磨至粉末状。

2、在研磨好的样品中加入800μl的预热好的4*CTAB，混匀，65℃水浴30min，期间轻摇样品3次，12000rpm离心10min。

3、加入600μl氯仿-异戊醇(24:1)，混匀，12000rpm离心6min。

4、吸取上清，重复步骤3，进行第二次抽提。

5、吸取上清，加入等体积的异丙醇(-20℃预冷)，室温静置5min，12000rpm离心10min。

6、弃上清，用75％预冷的乙醇漂洗2次。

7、真空抽干，加入50μlTE缓冲液，常温溶解，-20℃冰箱保存备用。

通过以上改良CTAB法提取香蕉叶片DNA，采用BioDropμLite(超微量蛋白核酸分析仪)检测其浓度和纯度，DNA浓度可达到80-150ng.μL^-1，OD260/OD280＝1.8-2.0，质量较好，符合试验要求。

表1香蕉抗感病品种资源表

注：“田间香蕉枯萎病抗性表现”为本单位在田间多年种植后田间观察的结果。

二、香蕉枯萎病感病品种特异条带SRAP标记的扩增

采用SRAP引物me6-em1对16个香蕉品种的扩增，将所得到的扩增产物进行凝胶电泳检，在凝胶成像仪中观察并照相，WS2(条带弱)、巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3、L1N2和G20-5七个品种产生800bp左右的特异条带(图1)，在紫外灯下分别切下这七个品种的特异条带，利用凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收，纯化。

采用的SRAP引物序列为：me6：5′-TGAGTCCAAACCGGGAC-3′

em1：5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′

PCR扩增反应在Bio-le PCR扩增仪上进行：PCR反应体系为25μl，含有10×buffer(含Mg2+)2.5ul，0.2mmol/L dNTPs(2.5nM)2ul，上下引物(10umol/L)分别1ul，DNA(50ng/L)1ul及1.5U TaqDNA聚合酶。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸7min。。扩增反应结束后，加入4ul 6×loading buffer，取8～10μL扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳，电极缓冲液为0.5×TBE。

三、香蕉枯萎病感病品种特异条带的回收测序

将800bp左右的特异条带在紫外灯下切下，采用Tiangel Midi purification kit试剂盒进行产物回收。对回收产物进行测序。将回收产物送样至赛墨飞世尔科技(中国)有限公司广州分公司进行测序。测序后得到四个品种：巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3(WS2、G20-5、L1N2这个品种由于回收浓度低测序未成功)的该片段的核苷酸序列：

巴西蕉的序列(829bp)：

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G30的序列(829bp)：

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NK4-1的序列(829bp)：

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L3-3的序列(829bp)：

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四、香蕉枯萎病感病品种特异条带的序列分析

将回收测序获得的巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3的序列在聚类分析软件MAGE6.0中进行排列比对，从图4看，巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3的序列是一致的。

五、香蕉枯萎病感病SCAR引物的设计及其扩增条件筛选

利用引物在线设计工具NCBI/primer-BLAST，进行引物设计，共设计了4对引物(引物序列见表2)，利用巴西、NK、G30、L3-3、WS2、南天青、东蕉1号、农科一号、粤科1号、抗枯1号这十个品种进行引物筛选。

表2SCAR引物序列表

经过PCR程序及PCR体系的优化，其中引物SC1-SC2，扩增条带长度为324bp，从原特异条带的第216bp至第539bp。这对引物扩增后目的条带清晰(图2)，其中感病品种：巴西、NK、G30、L3-3、WS2扩增出了324bp的目标条带，抗病品种：南天青、东蕉1号、农科一号、粤科1号、抗枯1号无目标条带，且无其他杂带，符合试验要求。

其最优的PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸7min，循环35次；72℃延伸10min。

其最优的PCR体系：20μl的反应体积含有10×buffer(含Mg²⁺)2ul，0.2mmol/L dNTPs(2.5nM)2ul，上下引物(10umol/L)分别1ul，DNA(50ng/L)1ul及1U TaqDNA聚合酶

在1.2％的琼脂糖凝胶上，110v电压电泳25分钟后在凝胶成像仪照相。

六、香蕉枯萎病抗病SCAR标记的准确性检测

采用选定的SCAR引物SC1-SC2，扩大群体来验证标记的准确性，供试的香牙蕉品种：索马里香蕉、天宝矮蕉、威廉斯、龙州中把、粗把香牙蕉、G6-2、粤科1号、农科1号、抗枯5号、漳选8-1、广东2号、东莞高把香蕉、齐尾、红河矮蕉、浦北矮蕉、墨西哥香蕉、东莞中把香蕉、河口高把香蕉、荷兰香蕉、北大矮、那龙中把香蕉、南天黄、BXM51、科2(品种对香蕉枯萎病的抗性见表1)等24个品种。从图3看检测结果：索马里香蕉、天宝矮蕉、威廉斯、龙州中把、粗把香牙蕉、漳选8-1、广东2号、东莞高把香蕉、齐尾、红河矮蕉、浦北矮蕉、墨西哥香蕉、东莞中把香蕉、河口高把香蕉、荷兰香蕉、北大矮、那龙中把等17个香蕉品种有324bp的目的条带，而G6-2、粤科1号、农科1号、抗枯5号、南天黄、BXM51、科2等7个香蕉品种没有扩增出目的条带，该结果与品种田间种植对香蕉枯萎病的抗性是一致的。

可见，发明人设计的SCAR引物SC1-SC2可以鉴定不同香牙蕉品种对香蕉枯萎病的抗性。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。