一种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法及其在育种中的应用与流程

本发明属于抗病育种技术领域，具体涉及一种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法及其在大豆育种中的应用。

背景技术：
由大豆疫霉(PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)引起的大豆疫病是大豆生产中的一种毁灭性土传病害。该病已在我国多个省份都有发生。大豆疫霉在大豆所有生育期均可以侵染大豆，引起根腐、茎腐、植株矮化、枯萎和死亡，一般田块减产10％-30％，严重地块可达60％-90％，甚至造成绝产。目前全世界每年因大豆疫病造成的经济损失大约为10亿美元(Tyler，2007)。目前，研究人员一般通过下胚轴创伤接种法鉴定大豆对大豆疫病的抗性。采用下胚轴接种法，只能在幼苗期进行，且接种后感病材料死亡，导致后续实验无法开展。这一缺点在杂合大豆抗疫病植株F2群体的鉴定中尤为明显，会造成群体的损失，并无法进行重复鉴定。鉴于此，有必要发展研究新的方法以鉴定大豆对大豆疫病的抗性。

技术实现要素：
本发明的目的是为了提高大豆对大豆疫病抗性的鉴定效率，及避免传统鉴定方法会造成杂合抗病植株F2群体损失的缺陷，而提供一种新的鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法及其在大豆育种中的应用。本发明的鉴定方法操作简便，成本低廉，节约时间，且可以进行重复实验，同时不会损失待鉴定的实验材料，避免传统方法会造成实验材料群体性丢失的弊端。本发明提供的技术方案之一是：一种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法，其包括如下步骤：(1)接种体的制备：将大豆疫霉(PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)菌株接种于CA培养基、V8培养基或利马豆培养基，暗培养使菌株复壮，之后将富含菌体的培养基处理碎，即得接种体；(2)接种大豆植株材料：将步骤(1)所得的接种体盛装于检测容器中，选取待检大豆植株刚刚平展的绿色带柄叶片，将叶柄插入所述检测容器中的接种体中；(3)暗培养：将步骤(2)中接种了大豆材料的检测容器置于湿润的密闭空间中暗培养后判断结果，所述密闭空间的温度为22～27℃，所述密闭空间的相对湿度为90～100％；所述判断结果的判断标准为，当培养3～5天后，若叶片和叶柄保持绿色或叶柄上病斑的长度小于等于1.5cm，则待检大豆植株为抗病植株，若叶柄上病斑的长度大于1.5cm，则待检大豆植株为感病植株。本发明中，步骤(1)为接种体的制备。其中，所述大豆疫霉菌株为本领域常规所述的大豆疫霉菌株，包括各种不同毒力基因型的菌株，如PsMC1、Ps41-1和PsUSAR2等。所述的CA培养基为本领域常规所述，其具体配方为：以1L体积计，其中包括200g胡萝卜和20g琼脂。所述的V8培养基为本领域常规所述，其具体配方为：以1L体积计，其中含有果汁200g，CaCO33g，琼脂20g，其余为蒸馏水，pH5.8。所述的利马豆培养基为本领域常规所述，其配制方法为：以1L体积计，取利马豆粉60g，加水1000ml，在60℃水浴1h，双层纱布过滤去渣，上清液补足至1000ml，加入琼脂20g，煮沸后持续沸腾数分钟，冷却即得。在将大豆疫霉菌株接种于CA培养基之前，较佳地还包括对所述大豆疫霉菌株进行分离和纯化的步骤(S)：将大豆疫霉菌株在CA培养基上暗培养7～10d，培养温度为22～27℃(优选25℃)，之后接种感病大豆品种的幼苗恢复毒力，在植株发病后进行病原菌的分离和纯化，将得到的大豆疫霉菌株用于后续接种。步骤(1)中所述暗培养的温度较佳地为22～27℃(优选25℃)；所述暗培养的时间较佳地为7～10天。步骤(1)中所述的将富含菌体的培养基处理碎指采用本领域任何常规可行的方法将富含大豆疫霉菌菌体的CA培养基处理碎(最好至均匀)即可，如可以搅拌至细碎均匀，也可以捣碎。较佳地，所述处理为使用豆浆机将富含菌体的培养基处理碎。本发明中，步骤(2)为接种大豆植株材料。其中，所述的检测容器可以是本领域任何常规的容器，如EP管、小试管、离心管等均可，优选2～5mL的离心管。所述的待检大豆植株刚刚平展的绿色带柄叶片可以是植株合适部位的任意叶片，只要其健康、幼嫩且呈绿色即可，优选具有长度大于4cm的叶柄的绿色复叶。如本领域常规，所述绿色带柄叶片在接种前，叶柄部位一般需要进行外植体消毒，以防杂菌感染。较佳地，所述绿色复叶在接种前，去掉部分小叶(优选去掉侧生小叶，保留中间小叶)。在叶柄插入所述检测容器中的接种体中后，较佳地，使用湿脱脂棉在容器口对叶柄进行固定，所述固定同时将去掉小叶形成的创口隔绝空气。本发明中，步骤(3)为暗培养。其中，所述密闭空间可以是本领域常规的无菌空间，如可以选用规格较大的塑料盒。在具体操作中，则可以先将步骤(2)接种有大豆植株材料的检测容器(如离心管)置于冷冻盒，再将冷冻盒放置在大塑料盒中，最后将大塑料盒置于高温高湿环境(优选25℃，90～100％RH)进行暗培养。所述鉴定方法的一较佳实例包括如下步骤：(1)接种体的制备：将大豆疫霉菌株在CA培养基上暗培养7～10d，培养温度为25℃，之后接种感病大豆品种的幼苗恢复毒力，在植株发病后进行病原菌的分离和纯化，将纯化得到的大豆疫霉菌株接种于CA培养基，暗培养7～10d，之后将富含菌体的培养基用豆浆机打碎至均匀，即得接种体；(2)接种大豆植株材料：将步骤(1)所得的接种体盛装于2mL去盖离心管中，选取待检大豆植株具有长度大于4cm的叶柄的刚刚平展的绿色复叶，将所述复叶两侧的小叶去除，将叶柄插入所述离心管中的接种体中，用湿润的脱脂棉在离心管口对叶柄进行固定同时将去除小叶形成的创口隔绝空气；(3)暗培养：将步骤(2)中接种了大豆材料的离心管放入冷冻盒中，将所述冷冻盒放置在底部铺有湿润海绵的密封塑料盒中，将所述密封塑料盒置于25℃暗培养4天判断结果，所述判断结果的判断标准为，当...