一种鉴定评价芝麻枯萎病抗性水平的方法与流程

本发明属于作物品种抗病性评价及时领域，具体涉及一种用于芝麻的枯萎病抗性鉴定评价方法。

背景技术：

芝麻是我国重要的特色油料作物。芝麻枯萎病主要是由尖孢镰刀菌芝麻专化型（fusariumoxysporumf.sp.sesami，fos）引起的，也是世界性芝麻病害。与茎点枯病并称为芝麻生产中的两大真菌病害。芝麻枯萎病常年发病率在15%左右，严重时可达30%以上，对产量和品质影响较大。

近年来，为检测尖孢镰刀菌芝麻专化型的致病力，评价芝麻种质对枯萎病菌的抗性水平，河南省农科院芝麻研究中心采用种子接菌方法，首次建立了芝麻枯萎病菌致病力的室内评价体系（仇存璞等，2014），为芝麻病害研究奠定了技术基础。该方法采用基质拌菌，对芝麻萌发的种子进行人工接菌处理，可以客观评价种子萌发至2对真叶时期芝麻抗枯萎病特性以及fos病菌致病力水平。

研究也发现，采用种子接菌方法检测芝麻种质的抗病性仍存在一定缺陷。利用该方法处理芝麻种子后，芝麻抗病水平在接种4周后（即芝麻栽培品种两对真叶时期）趋于稳定，不利于芝麻病症的进一步观察；对于一些强致病力fos菌株，大多数芝麻材料在子叶期就会全部死亡，致使枯萎病害症状表现不完全，并在一定程度上影响了病原菌致病过程观察以及芝麻抗病、应答过程监测。因此，目前迫切需要建立一种新型的芝麻枯萎病抗性室内鉴定评价方法，在一定程度上替代大田病圃检测方法，探明芝麻在不同发育时期对枯萎病菌的抗性特征，同时通过评价尖孢镰刀菌芝麻专化型病菌对不同发育时期芝麻植株的侵染特点，最终为有效防控芝麻枯萎病害提供理论和技术支持。

技术实现要素：

利用浸根接菌法，本发明目的在于提供一种较为通用的快速准确鉴定、评价芝麻枯萎病抗性的方法，从而为抗枯萎病芝麻种质筛选、致病菌株致病力鉴定及芝麻枯萎病防治等研究奠定技术基础。

本发明所采取的技术方案详述如下。

一种鉴定评价芝麻枯萎病抗性水平的方法，具体包括如下步骤：

（1）准备芝麻植株

根据试验目的，挑选适量待测芝麻品种健康成熟种子，灭菌处理后，25℃~28℃、100~120rpm条件下振荡培养至种子露白；

所述灭菌处理具体程序例如为：先用70%酒精处理30s，再3%的次氯酸钠处理10~15min，最后无菌水冲洗3~5次；

将露白后芝麻种子播种于盛有无菌蛭石的容器中，所述容器例如容量为250ml的纸杯，每个纸杯中可播种10粒；

定期用改良hoagland营养液进行浇灌，人工气候培养箱培养，培养温度25~28℃、相对湿度为60~80%、每天15h/9h光暗交替；培育1~2个月后可用于接菌处理（根据实验设计及要求，芝麻植株为2对真叶期至现蕾期中某一生长阶段）；

所述改良hoagland营养液配方为：四水硝酸钙945mg/l、硝酸钾506mg/l、硝酸铵80mg/l、磷酸二氢钾136mg/l、硫酸镁493mg/l、铁盐溶液2.5ml和微量元素液5ml，ph=6.0；

铁盐溶液：七水硫酸亚铁2.78g和乙二胺四乙酸二钠（edta-na）3.73g，蒸馏水500ml，ph=5.5；

微量元素液：碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌8.6mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l；

（2）制备浸染用分生孢子悬浮液

根据试验目的，挑选测试尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株，用接种针挑取少量固体保存的菌落（通常-20℃保存）接入300ml的pdb液体培养基中，28℃、160~180rpm振荡培养2~3d；

然后用无菌医用纱布过滤，在滤液中加入无菌水稀释，调整悬浮液中孢子数为：1×10⁶cfu/ml~1×10⁷cfu/ml；

所述pdb液体培养基，每1000ml蒸馏水中含：马铃薯200g，葡萄糖20g；

（3）浸根接菌

选择步骤（1）中生长健壮一致的芝麻植株，洗去根部粘带的蛭石，并用吸水纸快速吸去根部水分；

将芝麻植株根系全部浸入步骤（2）所制备分生孢子悬浮液中10~30min；

将接菌后植株重新栽入蛭石中，放入人工气候培养箱内，25-28℃、相对湿度为60-80%、每天15h/9h光暗交替条件下培养；期间定期浇灌改良hoagland营养液，保证植株生长需要的营养；

以清水浸泡同等时间的芝麻幼苗作为不接菌阴性对照，相同培养条件培养；

（4）芝麻品种枯萎病抗性鉴定评价，

对步骤（3）中接菌后芝麻植株的枯萎病发病情况进行定期调查，记录发病株数及发病等级，计算枯萎病病情指数，并据此判定芝麻品种枯萎病抗性能力，或者对特定菌株（步骤（2）中所挑选菌株）的对芝麻的枯萎病致病能力进行判定；

枯萎病病情指数计算公式为：病情指数＝σ（发病等级×相应发病株数）/总株数；

所述芝麻枯萎病发生等级划分标准为：

0级：长势良好无病症，地上部茎叶正常，根茎部维管束正常；

i级：病株茎叶萎蔫或半边黄，根茎部维管束红褐色；

ii级：病株叶片干枯至全株死亡；

芝麻品种的抗病性水平等级划分为五级（参考仇存璞等2014年在《植物病理学报》的《芝麻枯萎病病原菌致病力室内鉴定方法》论文进行设定）：

第一等级：高抗病，平均病指0~15；

第二等级：抗病，平均病指15.1~30；

第三等级：中抗，平均病指30.1~55；

第四等级：感病，平均病指55.1~70；

第五等级：高感，平均病指70.1~100；

fos菌株致病力等级划分为四级（参考仇存璞等2014年在《植物病理学报》的《芝麻枯萎病病原菌致病力室内鉴定方法》论文进行设定）:

0级：无致病力，平均病指为0；

1级：弱致病力，平均病指0.1~20；

2级：中等致病力，平均病指20.1~35；

3级：强致病力，平均病指35.1~100。

为避免接菌处理过程中芝麻植株根部受损，进而影响到植株抗病水平的鉴定，本申请首先对芝麻植株培育体系进行了优化，采用质地松散的纯蛭石做为培养基质，设计特定改良的hoagland营养液作为浇灌材料，保证了芝麻植株正常营养供给，同时较好兼顾了芝麻植株接菌处理的便捷性，为芝麻抗病能力或者菌株致病力判定奠定了良好基础。

本申请以较为成熟的浸根感染法为基础，可对不同生长阶段的芝麻植株（2对真叶至现蕾期）进行接种。同时，由于接种用的枯萎病菌株浓度易于调整，因而详细分析病菌对芝麻幼苗的侵染过程及芝麻幼苗的应答过程，能够准确鉴定和评价不同芝麻种质的抗病性以及不同菌株的致病力，为有效防控芝麻枯萎病提供了技术基础，同时也为其他作物病害的防治提供了较好地参考借鉴。

总体而言，本申请具有较好的可重复性，鉴定结果稳定可靠，能够较为准确的反映尖孢镰刀菌株与芝麻测试品种的互作关系，可为枯萎病菌侵染芝麻过程分析、枯萎病菌防治药剂筛选等研究奠定良好的理论基础，具有较好的科研应用价值。

附图说明

图1尖孢镰刀菌株hsfo08027不同浓度菌液浸根处理后芝麻发病情况；其中：a：豫芝11号在接种1×10⁶cfu/ml（中）和5×10⁶cfu/ml浓度菌液（右）后第10天发病情况和清水对照（左）；b：y11-m9956在接种1×10⁶cfu/ml（中）和5×10⁶cfu/ml浓度菌液（右）后第10天发病情况和清水对照（左）；c：豫芝11号在接种1×10⁶cfu/ml（中）和5×10⁶cfu/ml浓度菌液（右）后第14天发病情况和清水对照（左）；d：y11-m9956在接种1×10⁶cfu/ml（中）和5×10⁶cfu/ml浓度菌液（右）后第14天发病情况和清水对照（左）；

图2尖孢镰刀菌hsfo15110菌液浸根处理后的芝麻发病情况（第14天）；其中：a：y11-m9956接菌处理（右）及阴性对照（左）；b：豫芝11号接菌处理（右）及阴性对照（左）。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍如下。

生物材料：

芝麻品种：豫芝11号、y11-m9956（豫芝11号为河南省农业科学院芝麻研究中心选育的芝麻栽培品种，y11-m9956为芝麻种质资源），均由河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库保存并提供；

病原菌株：hsfo08027、hsfo15050、hsfo15098、hsfo15099、hsfo15100和hsfo15110共6个尖孢镰刀菌芝麻专化型（fos）菌株，由河南省农业科学院芝麻研究中心病理室分离鉴定，保存于河南省农业科学院芝麻研究中心芝麻枯萎病菌库。

实施例1

本实施例以豫芝11号、y11-m9956为例，对这两个品种（系）的枯萎病抗性进行了初步鉴定，具体过程简要介绍如下。

（1）准备芝麻植株

分别挑取豫芝11号和y11-m9956两个芝麻品种（系）的饱满种子各100粒，灭菌处理，然后28℃、120rpm条件下振荡培养至种子露白；

所述灭菌处理具体程序为：先用70%酒精处理30s，再3%的次氯酸钠处理10min，最后无菌水冲洗3~5次；

将露白种子播于装有无菌蛭石的纸杯中，每个纸杯中可播种10粒；

每3天浇灌1次改良hoagland营养液，人工气候培养箱中培养，温度25-28℃、相对湿度为60-80%、每天15h/9h光暗交替，20d后用于抗枯萎病水平鉴定。

所述改良hoagland营养液配方为：四水硝酸钙945mg/l、硝酸钾506mg/l、硝酸铵80mg/l、磷酸二氢钾136mg/l、硫酸镁493mg/l、铁盐溶液2.5ml和微量元素液5ml，ph=6.0；

铁盐溶液：七水硫酸亚铁2.78g和乙二胺四乙酸二钠（edta-na）3.73g，蒸馏水500ml，ph=5.5；

微量元素液：碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌8.6mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l。

（2）制备浸染用分生孢子悬浮液

挑选强制病力的尖孢镰刀菌芝麻专化型（fos）标准菌株hsfo08027，挑取少量菌块（-20℃保存）接入300ml的pdb液体培养基中，28℃、160rpm振荡培养3d；

然后用无菌医用纱布过滤，在滤液中加入无菌水稀释，调整悬浮液中孢子数分别为：1×10⁶cfu/ml和5×10⁶cfu/ml；以便对不同浓度菌株的致病力加以区分；

所述pdb液体培养基，每1000ml蒸馏水中含：马铃薯200g，葡萄糖20g。

（3）浸根接菌

选择步骤（1）中生长健壮一致的芝麻植株，洗去根部粘带的蛭石，并用吸水纸快速吸去根部水分；

将芝麻植株分为两组，将其根系分别完全浸入步骤（2）配制的1×10⁶cfu/ml和5×10⁶cfu/ml分生孢子悬浮液中，浸泡15min；

浸泡结束后，再分别栽入无菌蛭石中，每个营养钵中可栽种植株5株，25℃、相对湿度为80%、每天15h/9h光暗交替继续培养；

每3天浇灌改良hoagland营养液1次，保证植株生长需要的营养和水分；

相同操作，以清水浸泡同等时间的芝麻幼苗作为不接菌阴性对照，相同培养条件培养。

（4）芝麻品种枯萎病抗性鉴定评价，

对步骤（3）中接菌后芝麻幼苗枯萎病发病情况进行定期调查，记录发病株数及发病等级，计算枯萎病病情指数，并据此判定芝麻品种枯萎病抗性能力，或者对特定菌株的对芝麻的枯萎病致病能力进行判定；

枯萎病病情指数计算公式为：病情指数＝σ（发病等级×相应发病株数）/总株数；

所述芝麻枯萎病等级划分标准设定为：

0级：长势良好无病症，地上部茎叶正常，根茎部维管束正常；

i级：病株茎叶萎蔫或半边黄，根茎部维管束红褐色；

ii级：病株叶片干枯至全株死亡。

芝麻品种的抗病性水平等级划分为五级（参照仇存璞等2014论文）：

第一等级：高抗病，平均病指0~15；

第二等级：抗病，平均病指15.1~30；

第三等级：中抗，平均病指30.1~55；

第四等级：感病，平均病指55.1~70；

第五等级：高感，平均病指70.1~100；

fos菌株致病力等级划分为四级（参照仇存璞等2014论文）：

0级：无致病力，平均病指为0；

1级：弱致病力，平均病指0.1~20；

2级：中等致病力，平均病指20.1~35；

3级：强致病力，平均病指35.1~100。

分别在接菌后第7、14、21d调查每个处理中芝麻植株的生长和发病情况，并计算病情指数，具体结果如下表1所示。

表1：不同浓度hsfo08027菌株处理后的芝麻枯萎病情指数变化

。

从上表结果可以看出，在1×10⁶cfu/ml和5×10⁶cfu/ml接菌浓度条件下，hsfo08027菌株均可侵染豫芝11号及y11-m9956，并导致植株发病（如图2）。结果证实了hsfo08027确实为强致病力芝麻枯萎病菌株，与以往研究结果一致。

根据上述芝麻种质的枯萎病抗性水平等级划分标准和病情指数结果，我们也可以看出，相对hsfo08027菌株，在1×10⁶cfu/ml接菌浓度下，豫芝11号和y11-m9956均为高感枯萎病品种（系）。从接菌后第7天到14天，两个测试材料的病情指数均呈逐步上升趋势，且2品种（系）间的病情指数差异不大。植株发病表现如图1。该结果也为以后接菌浓度提供了依据。

实施例2

本实施例以5株尖孢镰刀菌芝麻专化型（fos）菌株（hsfo15050、hsfo15098、hsfo15099、hsfo15100和hsfo15110）为例，分别对其芝麻的致病力进行了评价，具体实验过程简要介绍如下。

（1）准备芝麻植株

分别选取豫芝11号和y11-m9956两个芝麻品种（系）的种子进行致病力评价，具体芝麻材料培养种植过程同实施例1。

（2）制备浸染用分生孢子悬浮液

针对不同的尖孢镰刀菌芝麻专化型（fos）菌株（hsfo15050、hsfo15098、hsfo15099、hsfo15100和hsfo15110），分生孢子悬浮液的制备过程同实施例1，发酵完成后，将不同菌株的分生孢子悬浮液中菌体数分别调整为1×10⁶cfu/ml。

（3）浸根接菌

将待测的豫芝11号和y11-m9956的芝麻植株分别浸入步骤（2）中所制备分生孢子悬浮液中，浸泡15min；具体操作同实施例1。

（4）芝麻品种枯萎病抗性鉴定评价，即对不同菌株的致病力进行评价。

接菌后分别在接菌后第7、14、21和28d调查每钵芝麻植株的生长和发病情况，调查结果见表2。

表2不同fos病菌处理后的芝麻病情指数变化：

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对上表分析可以看出，在1×10⁶cfu/ml接菌浓度条件下，上述5个菌株对豫芝11号和y11-m9956的致病力表现不尽相同。例如，在接菌后第28d时，hsfo15050处理下，豫芝11号和y11-m9956的病情指数均为100，表现为强致病力水平。在hsfo15099菌株处理下，豫芝11号和y11-m9956的病情指数分别为17.78和23.33，属于弱-中等致病力水平。同一品种对不同菌株的抗性水平也有差异。豫芝11号对于上述5个菌株的抗性水平为高感-抗病，y11-m9956的抗性水平为高感-高抗。此外，数据还显示了接菌处理7-28天芝麻抗病水平的变化情况，对芝麻抗病特征特性研究有积极的作用。部分处理植株表现如图2。