本发明涉及农作物病虫害抗性鉴定领域，具体涉及一种荞麦黑斑病抗性鉴定方法。
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：荞麦黑斑病是由链格孢(alternariaalternata)引起的一种重要真菌病害，广泛分布于我国荞麦种植区，为害严重时发病率可高达65～80％。该病害主要侵染荞麦叶片，造成叶片枯黄、早衰，植株生长缓慢，导致产量和品质严重下降，给荞麦生产造成严重的经济损失。荞麦黑斑病的发生为害已成为目前严重影响我国荞麦高产、优质的主要因素之一。因此，科学有效防控荞麦黑斑病将已成为现阶段荞麦生产提质增效和持续稳定发展的关键。利用抗病品种是防治荞麦黑斑病最经济有效的重要措施，而筛选抗病性荞麦种质资源是选育抗病性荞麦品种的基础。当前，国内尚无荞麦黑斑病抗性鉴定的方法及抗病性的荞麦种质资源，严重制约了荞麦黑斑病抗病性品种的选育，因此，当前研究建立荞麦黑斑病的抗性鉴定方法迫在眉睫。准确、稳定的荞麦黑斑病抗性鉴定方法，可为今后筛选抗病性荞麦种质资源筛选及抗病育种研究提供重要的技术保障，为有效防控荞麦黑斑病的奠定了重要的研究基础。技术实现要素：本发明的目的是提供一种鉴定荞麦黑斑病抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)对健康的荞麦叶片表面用无菌水处理后，用针头刺伤所述叶片正面，将黑斑病病原菌的孢子悬浮液接种于所述针刺点，得接种叶片；2)将所述接种叶片在恒温条件下进行培养，培养完成后测量病斑的大小；3)根据病斑的大小，进行抗性鉴定。优选的，所述荞麦叶片为荞麦植株4～5叶期的叶片。荞麦生育期较短(约90天)，在4～5叶期时荞麦叶片大小合适，比较适宜后期观察接种发病症状。优选的，所述针刺的部位需避开所述叶片的叶脉。该病害主要在叶片上出现症状，且病斑主要在叶肉区域，因此接种时避开叶脉，更符合该病害的症状特征。优选的，刺伤叶片的具体操作为用针头将所述叶片正面的叶肉部分刺伤。针刺的过程中注意仅刺伤不刺破。优选的，所述黑斑病病原菌的孢子悬浮液的浓度为1×106cfu/ml。优选的，所述孢子悬浮液的接种量为5μl。这个菌液浓度使病菌孢子的量达到一定程度，利于接种时孢子萌发侵染寄主；这种接接种量可足够覆盖针刺点。优选的，所述接种叶片在光照培养箱内进行培养，培养温度为25℃±1℃，光照强度8000～10000lux，光照和黑暗每12h交替一次，4d后测量接种叶片的病斑大小。上述条件更接近植物自然生长条件，可最大限度地模拟自然环境条件。优选的，所述步骤3)具体为：a、根据病斑的大小划分发病等级0级：无病斑，未发病；1级：病斑直径为0.01～0.50mm；3级：病斑直径为0.51～2.50mm；5级：病斑直径为2.51～4.50mm；7级：病斑直径为4.51～6.50mm；9级：病斑直径≥6.51mm；b、将所述发病等级带入病情指数计算公式，得病情指数：其中，公式中所述“各级代表值”即为叶片所属的发病等级，如0、1、3、5、7、9，所述最高病级即为9级。c、根据以病情指数划分的抗性等级，鉴定所述荞麦的抗性；所述抗性等级的划分标准为：高抗(hr)：病情指数≤35；中抗(mr):35<病情指数≤45；中感(ms)：45<病情指数≤55；高感(hs)：病情指数>55。本发明所述的方法，优选包括如下步骤：1)用无菌水对荞麦植株4～5叶期的健康叶片进行冲洗后，吸干表面水分，用针头刺伤所述叶片正面，然后将5ul浓度为1×106cfu/ml的病原菌孢子悬浮液接种于所述针刺点，得接种叶片；2)将所述接种叶片在光照培养箱内进行培养，培养温度为25℃±1℃，光照强度8000～10000lux，光照和黑暗每12h交替一次，4d后测量接种叶片的病斑大小；3)a、根据病斑的大小划分发病等级0级：无病斑，未发病；1级：病斑直径为0.01～0.50mm；3级：病斑直径为0.51～2.50mm；5级：病斑直径为2.51～4.50mm；7级：病斑直径为4.51～6.50mm；9级：病斑直径≥6.51mm；b、将所述发病等级带入病情指数计算公式，得病情指数：c、根据以病情指数划分的抗性等级，鉴定所述荞麦的抗性；所述抗性等级的划分标准为：高抗(hr)：病情指数≤35；中抗(mr):35<病情指数≤45；中感(ms)：45<病情指数≤55；高感(hs)：病情指数>55。本发明所述的方法具有如下有益效果：1)本发明所述的方法直接将孢子悬浮液接种于刺伤的叶片表面即可，操作简单，发病快，成本低，检测周期短。2)本发明的测评方法应用相对级数值0、1、3、5、7、9共9级6个不同水平对接种叶片的病斑进行分级，并计算病情指数，根据严重度判别抗病性。病害分级是根据调查的病斑大小数据在excel系统下进行排序，以无症状对应的样品的部位严重度指标设置为0，其余数据自低至高的连续读取数值分割为5段，各段分别代表一个病害严重度级别，即0、1、3、5、7、9共9级6个不同水平进行分级。根据不同级别的叶片计算病情指数，数据采用jmpver.5.0.1(sasinstituteinc2000)统计软件进行显著性分析，根据显著性确定病害抗感病情指数的划分。通过以上方法确定的测评方法可准确地对荞麦的抗性进行评价。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1本实施例涉及荞麦黑斑病抗性的具体评价实例：试验以在田间分别表现为高抗的品种米黑3号，中抗的品种棕苦2号，中感的品种ynk7，高感的品种ynk43为供试材料。荞麦材料种子由云南省农业科学院种质资源保存中心提供。黑斑病病原菌菌株及来源：黑斑病病原菌的强致病性菌株lw11，由本实验室荞麦病理研究室分离自云南安宁的样品。具体步骤：(1)将荞麦黑斑病病原菌的菌种移植至pda培养基平板活化培养7天；刮取培养物，用无菌水配制成浓度1×106cfu/ml孢子悬浮液，备用。(2)在荞麦植株4～5叶期，取取待鉴定新鲜、健康的荞麦叶片，用无菌水清洗，放置于规格为16cm×40cm不锈钢盘里的灭菌吸水纸上(不锈钢盘表面消毒，箱底铺两层灭菌滤纸)，晾干。(3)用灭菌大头针轻轻刺伤叶片正面(避开叶脉)后，用移液器取5μl孢子悬浮液于荞麦叶片的针刺点进行接种。(4)叶片接种结束后，将接种叶片放置于光照培养箱内培养，光照强度8000～10000lux，光照和黑暗每12h交替一次，每天观察记录接种叶片的发病情况，4d后测量接种叶片的病斑大小。(5)按发病等级划分标准进行分级并计算病情指数，根据病情指数进行荞麦黑斑病抗性水平评价，荞麦黑斑病发病等级划分标准和抗性等级划分标准如下：发病等级划分标准：0级：无病斑，未发病；1级：病斑直径为0.01～0.50mm；3级：病斑直径为0.51～2.50mm；5级：病斑直径为2.51～4.50mm；7级：病斑直径为4.51～6.50mm；9级：病斑直径≥6.51mm。病情指数计算公式：抗性等级划分标准：高抗(hr)：病情指数≤35；中抗(mr):35<病情指数≤45；中感(ms)：45<病情指数≤55；高感(hs)：病情指数>55。表1供试品种黑斑病孢子悬浮液人工接种抗性鉴定结果症状品种名称病斑直径(mm)*病情指数*抗性类型有病斑米黑3号1.2230.37hr有病斑棕苦2号2.0042.71mr有病斑ynk72.5651.65ms有病斑ynk343.4878.56hs*:病斑直径和病情指数均为3个重复的平均值。由以上结果可以看出，对于田间表现抗感的荞麦品种，通过抗性鉴定试验，其抗性鉴定结果与已知的实际情况相吻合。实施例2采用1所述方法对米黑3号、宁荞1号、棕苦2号、蒙0353、ynk43、云荞1号、ynk7进行黑斑病抗性鉴定。由一个实验人员采集以上7个不同荞麦品种的健康叶片，并采用阿拉伯数字对7个不同品种进行编号后，将只带有编号的叶片交给另外一个实验人员，按照方法1的步骤进行实验。待实验结束后，对照编号查品种名称。结果显示，7个不同荞麦品种对黑斑病的抗性表现差异明显，其中米黑3号、棕苦2号、ynk7、ynk43的抗性结果与大田中实际表现的结果一致。抗性鉴定验证试验再次证实，抗性鉴定结果与已知的实际情况相吻合。因此，验证了此方法可用于荞麦黑斑病的抗性快速鉴定。表2不同荞麦品种黑斑病孢子悬浮液人工接种抗性鉴定结果*:病斑直径和病情指数均为3个重复的平均值。由此可见，本发明的抗性鉴定方法具有易于操作、高效、稳定，检测周期短等优点，适合对大批量材料进行快速的抗病性鉴定，具有广阔的应用前景。当前第1页12