本发明属于生物技术领域，涉及一种基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的检测猪人住肉孢子虫的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
住肉孢子虫病是一类重要的食源性寄生虫病，是由复顶亚门、孢子虫纲、真球虫目、住肉孢子虫科、住肉孢子虫属原虫寄生于动物肌肉和各脏器毛细血管内皮细胞内所引起的一类人兽共患原虫病。目前，猪住肉孢子虫病的病原有三种：米氏住肉孢子虫(S.miescheriana)、猪人住肉孢子虫(S.suihominis)和猪猫住肉孢子虫(S.porcifelis)。猪人住肉孢子虫中间宿主是猪，终末宿主是人和非人类的灵长类动物，人食入猪肉中的肉孢子虫后有一定的危害，可引起人恶心、腹泻。因此，开展对猪人住肉孢子虫病的研究对人类健康及养殖业有重要的意义。
目前对猪住肉孢子虫病的诊断技术主要依赖于临床症状的观察、流行病学调查、剖检大体变化等作初步判断，而确诊则依赖显微镜检观察或组织病理学的染色技术。这些传统方法存在费时费事、灵敏性和特异性不强、检测程序繁琐、工作量大等不足，很难适应现代化食品安全快速检测的需要。虽然PCR方法虽然较传统方法拥有操作简单，灵敏性与特异性强等优点，但仍然需要3个小时左右的时间才能出结果，无法立即确诊，并且必须配备专用仪器，且常有非特异性出现。
环介导等温核酸扩增技术(LAMP)技术是一种新颖的恒温核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶，在等温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，并且反应结果可通过添加SYBR Green I观察体系颜色变化确定组织中是否感染猪人住肉孢子虫，若感染，则体系为黄绿色，未感染则为橙黄色。目前，LAMP技术已经广泛应到病原微生物的检测上，在寄生虫诊断方面也有部分报道，如旋毛虫、牛巴贝斯虫、胎儿毛滴虫、贾第虫、火鸡组织滴虫等，而在猪人住肉孢子虫方面的研究却是空白。与上述几种实验室诊断方法相比，环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术对仪器设备要求不高，具有操作简单、临床上容易做到、检测时间短的特点。中国专利ZL201210494834.3公开了一种适用于火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒，包括含有10x等温反应缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、四种引物混合液、甜菜碱和去离子水的反应液A，以及含有1000x的荧光染料SYBR Green I的反应液B，通过肉眼检测反应液颜色差异，实现至少为1个基因拷贝的检测灵敏度。然而，基于火鸡组织滴虫与猪人住肉孢子虫的病原学、寄生部位及各自生活史的不同，该试剂盒不能用于检测猪人住肉孢子虫。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种猪人住肉孢子虫LAMP检测试剂盒及其检测方法，从而快速、准确、而且更加灵敏、高效地检测猪人住肉孢子虫。其设计理念是：充分利用LAMP技术特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，并针对猪人住肉孢子虫对靶基因的特点设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种猪人住肉孢子虫LAMP检测试剂盒，包括以下成分：
(1)反应液A：
含有10x等温反应缓冲液、8000U/mL BstDNA聚合酶、0.5mM dNTP、2mM MgCl2、含1.4μM内引物1和1.4μM内引物2的内引物混合液、含0.2μM外引物1和0.2μM外引物2的外引物混合液、1M甜菜碱和去离子水，其中：
10x等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8.8)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％(m/V)曲拉通X-100(pH8.8，25℃)；
内引物1为:TCTACCATAAACTATGCCGACTAGACTTTGATTTCTCATGAGGTGC(SEQ ID No.1)，
内引物2为:ACCCCCTACTGTCGTTCTTGATTGTTAAAGACGAACTACTGCG(SEQ ID No.2)，
外引物1为:CGTATTTAACTGTCAGAGGTGA(SEQ ID No.3)，
外引物2为:TTCAGCCTTGCGACCATA(SEQ ID No.4)；
(2)反应液B：1000x荧光染料SYBR Green I。
本发明还提供了一种使用上述猪人住肉孢子虫LAMP检测试剂盒检测猪人住肉孢子虫的方法，其主要技术步骤包括：
1)提取待测样品DNA，制备DNA处理液；
2)猪人住肉孢子虫的环介导等温扩增：
将体积比为24:1的反应液A和步骤1)中所得的DNA处理液混匀离心，于60-65℃恒温放置45-60min；
3)扩增产物的显色检测：
在步骤2)中所得的混合液中加入反应液B，其体积比为25:1，反应结束后充分混合，肉眼观察反应液颜色：如颜色变为绿色，表明样品中猪人住肉孢子虫，如颜色为黄色，说明待检样品不含有猪人住肉孢子虫。
本发明还提供了上述猪人住肉孢子虫LAMP检测的引物组合、上述猪人住肉孢子虫LAMP检测试剂盒、以及上述猪人住肉孢子虫LAMP检测试剂盒的检测方法在检测猪人住肉孢子虫方面的应用。
本发明的技术方案达到了如下的有益效果：
a)本发明建立了猪人住肉孢子虫LAMP检测试剂盒，该试剂盒根据猪人住肉孢子虫的18SrRNA基因保守区的6个部位设定了4种引物分别为：两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为猪人住肉孢子虫所共有；
b)本发明采用LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于猪人住肉孢子虫的检测，特别适合于基层现场应用。
LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是对靶基因的6个部位设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。由于其反应是多种引物共同启动，使得反应结果比PCR更特异，另外，由于实行的是等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于现场快速检测。
本发明解决了现有技术中检测猪人住肉孢子虫的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷，提供的猪人住肉孢子虫的检测试剂盒及其检测方法，对猪人住肉孢子虫进行LAMP检测，快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便，可广泛应用于兽医、食品、出入境检疫领域。
附图说明
图1是具体实施例1的检测结果。
图中，左图：阳性样品，中图：阴性样品，右图：空白对照。
具体实施方式
为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
下列实例进一步说明本发明，但不应该当作对本发明的限制。
实施例1：
按下列配方制作猪人住肉孢子虫的环介导等温扩增检测试剂盒：
(1)反应液A：
含有10×等温反应缓冲液、8000U/ml Bst DNA聚合酶、0.5mM dNTP、2mM MgCl2、1.4μM内引物1和1.4μM内引物2混合液、0.2μM外引物1和0.2μM外引物2混合液、1M甜菜碱和去离子水，其中：
10×等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8.8)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％(m/V)曲拉通X-100(pH8.8，25℃)；
内引物1为:TCTACCATAAACTATGCCGACTAGACTTTGATTTCTCATGAGGTGC(SEQ ID No.1)
内引物2为:ACCCCCTACTGTCGTTCTTGATTGTTAAAGACGAACTACTGCG(SEQ ID No.2)
外引物1为:CGTATTTAACTGTCAGAGGTGA(SEQ ID No.3)
外引物2为:TTCAGCCTTGCGACCATA(SEQ ID No.4)
(2)反应液B：1000×的荧光染料SYBR Green I。
LAMP反应液A以每管24μL计，为2.5μL 10×等温反应缓冲液、1.0μL 8U/μL Bst DNA聚合酶、1.25μL 0.5mM dNTP、3μl 2mM MgCl2、2μL外引物混合液、7μL内引物混合液、2.5μL 1M甜菜碱、4.75μL去离子水。
实施例2：
利用猪人住肉孢子虫LAMP检测试剂盒检测猪人住肉孢子虫。
待测样本处理液制备：以样本取自猪肉为例，感染猪人住肉孢子虫猪肉作为阳性样品，正常猪肉作为阴性样品，同时设立不含样品的去离子水作为空白对照。
A.取猪肉组织0.5g，置于1.5mL离心管中，研磨后加入1mL的组织裂解液(100mM pH8.0Tris，500mM pH 8.0EDTA，20mM NaCL，10％SDS)；
B.加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)混匀，置于65℃恒温水浴锅中水浴30min；
C.12000×g离心5min，将上清移入新离心管中；
D.加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)振荡涡旋，12000×g离心5min，将上层液入另一离心管中；
E.加入2倍体积预冷的无水乙醇混匀，4℃沉淀20min，12000×g离心10min，去上清；
F.沉淀用800μL预冷的75％乙醇洗涤一次后12000×g，离心5min；
G.弃掉上清液，离心管倒置于吸水纸上，室温干燥2-3min；
H.用20μL去离水重新溶解干燥后的沉淀，然后置于-20℃保存备用。
检测：
(1)猪人住肉孢子虫的环介导等温扩增
在装有24μL反应液A的PCR反应管中分别加入1μL上述制得的待检阳性样品的DNA处理液、正常猪肉的DNA处理液或者灭菌去离子水，作为阳性对照、阴性对照以及空白对照，混匀离心，将1μL的反应液B分别滴在PCR管盖内侧中间，盖紧管盖(小心操作，以防显色液坠入反应混合液中)，于60-65℃恒温水浴箱中放置60min；
(2)扩增产物的显色检测
颠倒PCR管数次，使反应混合液与反应液B充分混合，观察反应液颜色，根据反应液的颜色变化肉眼判断检测结果。阳性对照颜色变为绿色，表明样品中含有猪人住肉孢子虫。阴性对照以及空白对照颜色为黄色，说明不含有猪人住肉孢子虫。检测试验结果如图1。
实施例3：猪人住肉孢子虫检测方法灵敏度试验
取含有猪人住肉孢子虫特异基因的质粒DNA，按10倍比稀释作为LAMP检测试验模板，使每μL稀释液中含有模板基因拷贝数分别为108，107，106，105，104，103，102，10，1；
在装有24μL反应液A的PCR反应管中分别加入1μL上述基因组稀释液，同时设置不加质粒DNA的空白对照，混匀离心，将1μL的反应液B滴在PCR管盖内侧中间，盖紧管盖于60-65℃恒温水浴箱中放置60min；
颠倒PCR管数次，使反应混合液与反应液B充分混合，肉眼观察反应液颜色，结果显示加有质粒DNA的反应管变为绿色，对照管颜色为黄色，说明该试剂盒的检测灵敏度至少为10个基因拷贝。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。