熊蜂短膜虫的分子检测方法
【专利摘要】本发明属于分子生物【技术领域】，具体公开了一种熊蜂短膜虫的分子检测方法，具体步骤如下：利用一对特异性ITS引物，对待检测蜂群的肠道DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，如扩增出675bp的短膜虫ITS基因片段，则标志着待检测蜂群感染了短膜虫。本发明还提供用于熊蜂短膜虫的分子检测方法的特异性ITS引物对。本发明的方法是一种准确、灵敏、快速的检验检疫进出口熊蜂、中华蜜蜂上的短膜虫的方法，而且费用较适中，使用的大部分检测试剂对人无害。
【专利说明】熊蜂短膜虫的分子检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物【技术领域】，具体涉及熊蜂短膜虫的分子检测方法。
【背景技术】
[0002]短膜虫(Crithidia)属于动鞭毛虫纲(Zoomastigophorea)、动质目(Kinetoplastida)、锥虫亚目(rrypanosomatina)、短膜虫属(Crithidia)。短膜虫属主要是无脊椎动物的寄生虫，全部寄生于昆虫，为昆虫肠道寄生原虫。商品化蜂群的应用规模越来越大，商品化蜂群在不同国家间的进出口也越来越频繁，如果预防不好，不可避免会传播一些病虫害，其中寄生虫是影响熊蜂、蜜蜂生态分布和商业化发展的主要因素之一，而且熊蜂寄生虫数量多、传播广泛，对熊蜂的繁育与产业化产生巨大影响，然而，熊蜂寄生虫的研究报到不多，特别是熊蜂短膜虫的研究报道更少，国外研究报告短膜虫是危害熊蜂的肠道寄生虫之一，因此，熊蜂短膜虫成为熊蜂进出口检验检疫的重要病原物之一。
[0003]熊蜂短膜虫检验通常采用镜检法。镜检法是将被检样品研磨后，滴加蒸馏水，取1-2滴在载玻片上，于光学显微镜下观察，极易漏检，而且短膜虫感染的蜂群没有任何明显的外部症状，及易与微孢子虫病混淆。
[0004]内转录间隔区ITS (internal transcribed space)位于 18S 和 5.8SrDNA 之间以及5.8S和28SrDNA之间。ITS序列作为分子标记在原虫、蠕虫、外寄生虫的研究中得到了广泛的应用。ITS序列已被证明是许多寄生虫分子分类学研究的有用标记，对ITS序列的研究为寄生虫的分类、鉴定、诊断、分子流行病学调查以及寄生虫病的防治等更深入的研究奠定了基础。2006年，邓莉 等对蛲虫rDNA的ITS-1的PCR扩增及序列分析，首次报道了人蛲虫的ITS-1序列，为以ITS-1作为遗传标记用于蛲虫鉴别诊断、系统发育等研究奠定基础。艾琳、王春仁、唐剑栋等于2007年,扩增绒山羊和绵羊源东毕吸虫(Orientobilharzia spp.)的ITS rDNA序列并进行分析比较，实验结果为:黑龙江绒山羊和绵羊东毕吸虫的ITS序列总长均为875bp，且黑龙江绒山羊和绵羊东毕吸虫的ITS序列相似性为99.9%，只有一个碱基差异。结论证实了绒山羊和绵羊源东毕吸虫代表同一个种。在2008年，Liu等测得不同的牛梨形虫ITS基因序列，构建的牛梨形虫的系统发生树表明，所有的牛巴贝斯虫独立占有一枝，泰勒虫独立占有一枝并认为。以上研究证明，ITS序列是寄生虫的分类、鉴定、诊断的快速、准确的方法之一。
【发明内容】
[0005]为准确、灵敏、快速、经济地检验检疫进出口蜂群上的短膜虫，本发明的目的是提供一种熊蜂短膜虫的分子检测方法。
[0006]本发明提供的熊蜂短膜虫的分子检测方法，具体步骤如下:
[0007]利用特异性ITS引物对，对待检测蜂群的肠道DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，如扩增出675bp的短膜虫ITS基因片段，则标志着待检测蜂群感染了短膜虫。
[0008]其中，所述特异性ITS引物对为:[0009]Cr1-1ts-bl2:5’-AGGAAGCCAAGTCATCCATCGC-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0010]Cr1-1ts-f4:5，-GGTCTATGTGATTCCGTGGTTTCC-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0011]其中，待检测蜂群的肠道DNA以常规方法提取。
[0012]其中，所述凝胶电泳为2.0%琼脂糖凝胶电泳。
[0013]其中，所述蜂群为熊蜂蜂群或中华蜜蜂蜂群。
[0014]其中，所述PCR的反应体系如下:
[0015]
【权利要求】
1.熊蜂短膜虫的分子检测方法，其特征在于，具体步骤如下: 利用特异性ITS引物对，对待检测蜂群的肠道DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，如扩增出675bp的短膜虫ITS基因片段，则标志着待检测蜂群感染了短膜虫。
2.如权利要求1所述的熊蜂短膜虫的分子检测方法，其特征在于，所述特异性ITS引物对为: Cr1-1ts-bl2:5’ -AGGAAGCCAAGTCATCCATCGC-3’(如 SEQ ID N0.1 所示) Cr1-1ts-f4:5’ -GGTCTATGTGATTCCGTGGTTTCC-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
3.如权利要求1所述的熊蜂短膜虫的分子检测方法，其特征在于，所述凝胶电泳为2.0 %琼脂糖凝胶电泳。
4.如权利要求1所述的熊蜂短膜虫的分子检测方法，其特征在于，所述蜂群为熊蜂蜂群或中华蜜蜂蜂群。
5.如权利要求1所述的熊蜂短膜虫的分子检测方法，其特征在于，所述PCR的反应体系如下:
5 xGoTaq Buffer5 μ IMgCl2 (25mM)1.5 μ IdNTPs ( 200μΜ)2.0 μ I`
引物 Cr1-1ts-bl2 ( ΙΟμΜ)I μ?`
引物 Cr1-1ts-f4 (ΙΟμΜ)I μ?GoTaq DNA 聚合酶0.625 μ I
模板 DNA ( 5 ng/μ?)5 μ?ddH208.875 μ? 反应体系总体积为25 μ I。
6.如权利要求1所述的熊蜂短膜虫的分子检测方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为:95°C预变性4min后进入循环，95°C变性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸lmin，32个循环，最后72°C延伸lOmin。
7.用于权利要求1-6任一项所述的熊蜂短膜虫的分子检测方法的特异性ITS引物对: Cr1-1ts-bl2:5’ -AGGAAGCCAAGTCATCCATCGC-3’(如 SEQ ID N0.1 所示) Cr1-1ts-f4:5’ -GGTCTATGTGATTCCGTGGTTTCC-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
8.权利要求1-6任一项所述的熊蜂短膜虫的分子检测方法在熊蜂或中华蜜蜂检验检疫中的应用。
9.权利要求7所述的用于熊蜂短膜虫的分子检测方法的特异性ITS引物对在熊蜂或中华蜜蜂检验检疫中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103820540SQ201410033331
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】李继莲, 吴杰, 彭文君, 安建东, 罗术东, 黄家兴 申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所