本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及显性家系遗传病致病位点的筛查。
背景技术：
：近年来，随着基因组高通量测序技术的发展，使得越来越多的显性家系遗传病的致病位点得以揭示，这对诊断治疗和优生优育具有重要的指导意义。目前，显性家系遗传病已知突变的筛查方法主要是采用常规的测序方法或芯片方法把这种遗传病已鉴定的位点筛查一遍，看该家系的突变是否是已报道的突变，已知突变的筛查费用可能从几百到几千元不等，具体看该遗传病已报道的突变基因多不多。显性家系遗传病致病未知突变的筛查方法主要是采用外显子高通量测序方法，虽然全外显子高通量测序的费用已经降到几千元，但是筛查显性家系遗传病未知突变，需要测2个及以上患病个体样品才有可能鉴定出显性家系遗传病的致病位点。因此，显性家系遗传病不论是已知突变还是未知突变的筛查均需花费高额的费用。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种既可以用于显性家系遗传病已知突变也可以用于显性家系遗传病未知突变的，且与现有技术相比成本极大降低的快速筛查方法。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：一种显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法，该筛查方法是先采用DNA池结合全外显子高通量测序方法筛查到显性家系遗传病的低频致病位点，然后采用PCR扩增和sanger测序验证确定显性家系遗传病的致病位点。上述快速筛查方法中，先采用DNA池结合全外显子高通量测序方法筛查到显性家系遗传病的低频致病位点，所述低频致病位点为候选位点，然后通过PCR扩增和sanger测序从前述的候选低频致病位点中最终确定得到显性家系遗传病的致病位点。上述一种显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法，该筛查方法具体包括如下步骤：步骤1.分别收集遗传病家系中患病个体的血样样本和未患病个体的血样样本，将所有血样样本分别提取基因组DNA，然后将患病个体的基因组DNA分别用无菌水稀释后等体积混合得到混合DNA池；步骤2.对步骤1制备的混合DNA池进行全外显子高通量测序，对测序结果进行生物信息分析筛选出候选低频致病位点；步骤3.根据步骤2筛选的候选低频致病位点设计扩增引物，然后用扩增引物分别扩增步骤1得到的患病个体基因组DNA和未患病个体基因组DNA，将所有的PCR扩增产物进行sanger测序，对比患病个体的测序结果和未患病个体的测序结果从而从步骤2筛选的候选低频致病位点中筛查得到导致该显性家系遗传病的致病位点。上述显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法中，所述分别收集遗传病家系中患病个体的血样样本和未患病个体的血样样本，患病个体的血样样本收集数目至少2个及以上，未患病个体的血样样本收集数目至少2个及以上。上述显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法中，所述将所有血样样本分别提取基因组DNA，所采用的基因组DNA提取方法采用本领域技术人员的常规操作即可，具体可参考相关试剂盒说明。上述显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法中，所述将患病个体的基因组DNA分别用无菌水稀释，是将每个患病个体的基因组DNA稀释至等浓度，如可都稀释至10ug/uL。上述显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法中，所述混合DNA池只需要制备一个即可。上述显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法中，所述低频致病位点是指等位基因的频率满足≤0.05的位点。本发明的显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法不但适用于显性遗传病已知突变的筛查，还适用于显性家系遗传病未知突变的筛查，对于未知突变的筛查可降低约50％以上的成本。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.常规的筛查流程是先用Sanger或其他方法筛查已知突变，如果未发现已知突变，才开始用全外显子高通量测序筛查未知突变；而本发明的快速筛查方法可一次性的快速有效的筛查出遗传病家系的致病位点是已知的还是未知的突变，在流程上节省了很多时间；2.显性家系遗传病未知致病位点筛查，常规流程一般要测2个甚至更多个患者样本才能有效的找出致病位点，成本相对较高；而本发明的快速筛查方法采用多个样本混合成一个DNA池，因此只需测1个池样本就可以快速有效的筛查到遗传病家系未知致病位点，使测序成本降低50％以上。附图说明图1为DRD家系图；其中，1为发病男性个体，2为未发病男性个体，3为发病女性个体，4为发病男性个体，5为未发病女性个体，6为未发病男性个体。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。本实施例以多巴胺反应性肌张力障碍(简称DRD)家系为例，采用本发明的显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法对其进行致病位点的筛查，具体步骤如下所示：1、DRD家系本实施例DRD家系如图1所示，一共采集到6个样本，3个发病个体，3个未发病个体。2、混合DNA池的制备将6个样本分别采集2mL全血，EDTA抗凝，然后对这6个血样样本分别进行基因组DNA的制备，具体操作方法按照普博欣生物科技有限公司生产制造的血液基因组微量DNA提取试剂盒自带的说明书进行。将上述制备得到的6个样本的基因组DNA分别使用紫外分光光度计测定浓度，然后再用无菌水分别将各样本基因组DNA稀释至10ng/ul。将3个患病样本的基因组DNA等体积混合制备得到混合DNA池，一共制备3个混合DNA池，送到上海伯豪进行全外显子高通量测序。本发明的显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法只需要制备一个混合DNA池，然后送去全外显子高通量测序即可，但本实施例制备3个混合DNA池，主要目的是做三个平行样来验证试验的准确性。3、全外显子高通量测序和数据分析采用安捷伦全外显子组捕获芯片和Illummina公司的HiSeq2500测序仪，对上述制备的3个混合DNA池分别进行全外显子高通量测序，测序结果见表1。表1测序序列及比对结果注：Q20＝basesofQ>＝20/allbasesofsequencing；GoodReads：通过测序仪过滤的reads数目；mappedreads：比对到参考序列上的reads数目；mapratio：mappedreads在Filteredreads中所占的百分比数；UniqueMappedReads：唯一比对到基因组的reads数目；UniqueMappedRatio：UniqueMappedReads在mappedreads中所占的百分比数。测序结果采用Bowtie2软件进行比对序列分析，GATKUnifiedGenotyper软件处理数据结果。根据测序数据的可信度，在三个混合DNA池样本数据分析结果中，共筛选出了5个低频(低频等位基因的频率满足≤0.05)未被报道的致病位点，推测这5个候选低频致病位点中可能存在与DRD致病基因相关的致病位点；其中SNP176在3个DNA池都能筛选出来。4、PCR扩增和Sanger测序验证根据上述筛选出的5个候选低频位点设计上游引物1F(核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)、下游引物1R(核苷酸序列如SEQIDNO：2所示)、上游引物2F(核苷酸序列如SEQIDNO：3所示)、下游引物2R(核苷酸序列如SEQIDNO：4所示)、上游引物3F(核苷酸序列如SEQIDNO：5所示)、下游引物3R(核苷酸序列如SEQIDNO：6所示)、上游引物4F(核苷酸序列如SEQIDNO：7所示)、下游引物4R(核苷酸序列如SEQIDNO：8所示)、上游引物5F(核苷酸序列如SEQIDNO：9所示)和下游引物5R(核苷酸序列如SEQIDNO：10所示)，具体如表2所示。表2PCR扩增引物序列信息采用上述5对引物分别对前述制备的3个发病个体基因组DNA和3个未发病个体基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表3所示。表3PCR反应体系名称浓度体积基因组DNA10ng/μL5μL上游引物10μM0.8μL下游引物10μM0.8μLPCRkit(2×)10μLddH2O3.4μLPCR反应条件是现94℃变性3min，然后94℃30s，合适退火温度℃(详见表2)30s，72℃30s共35个循环，再72℃8min，16℃保存。观察PCR扩增产物的凝胶电泳，扩增产物的电泳条带单一、明亮，无拖带现象。将所有的PCR扩增产物进行Sanger测序，结果如表4所示。表4目标SNP位点在个体中的基因分型从表4可以看出，SNP176在患病和未患病个体存在完全不同的差异，因此可以确定SNP176就是导致家系DRD疾病的致病位点。本实施例为了验证试验准确性是做了三个平行混合DNA池，而SNP176在3个混合DNA池中都能被外显子捕获和高通量测序及生物信息分析给筛选出来，说明本发明利用DNA池和全外显子高通量测序技术快速筛查显性家系遗传病致病位点的方法是可行的。SEQUENCELISTING<110>广州泰因生物科技有限公司<120>一种显性家系遗传病致病位点的快速筛查方法<130><160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工引物1F<400>1gctggtaaagagtagacagg20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工引物1R<400>2gtatgtttaggtgaagaggg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工引物2F<400>3agtgaaatctgctggcttct20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工引物2R<400>4ctgattggaaaggtcctgtg20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工引物3F<400>5agggctgagggtatctttag20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工引物3R<400>6tggatatgtaggcgcagaac20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工引物4F<400>7tccagacatggctgaaatcc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工引物4R<400>8acacgcactgctacctccct20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工引物5F<400>9agggagattcctagacttcg20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工引物5R<400>10aaagtcacaaatgggacacg20当前第1页1 2 3