本发明属于农业分子生物技术领域，涉及一种鉴别杂交水稻细胞质雄性不育系花粉败育类型为典败型(败育花粉为不规则形状，不可被碘染色)与染败型(败育花粉为圆形，可被碘部分染色)的PCR方法。
背景技术：
作为提高水稻产量的有效措施，杂交水稻已在我国得到广泛应用。长期以来广泛应用的三系杂交水稻技术体系的核心是细胞质雄性不育系。
用1％的I2-KI溶液对花粉染色镜检可将生产上应用的细胞质雄性不育系分为典败型、圆败型和染败型不育系(李炳泽等，杂交水稻的研究与实践，上海科学技术出版社，1982,18-103)。显微镜下，花粉粒为梭形、菱形或其他不规则形状，不被I2-KI溶液染色，为典败型花粉；花粉粒为圆形且不被I2-KI溶液染色，为圆败型花粉粒；花粉粒为圆形可被部分染色，呈现棕色或黑色，为染败型花粉。显微镜下败育花粉粒所占的比例决定不育系的主要败育类型。生产上应用的极大多数的细胞质雄性不育系或为典败型或为染败型，只有少数如红莲型、茶野型不育系是圆败型。
不育系的花粉败育类型与其育性的可恢复性密切相关，既影响着不育系的应用，又影响与恢复系组配的杂交稻的结实率，因此，鉴定不育系的花粉败育类型对杂交育种具有重要意义。目前，鉴别不育系花粉败育类型唯一方法是等待不育系进入开花期，取花粉用I2-KI溶液染色、镜检观察，从而判断不育系花粉的败育类型。这种方法只有在不育系进入开花期获得花粉后才可进行，而且由于水稻在整个生育期都可能受到自然条件的胁迫，影响花粉的败育。因此，建立一种准确、快速鉴别杂交水稻典败型和染败型细胞质雄性不育系的方法十分必要。
水稻分子生物学的研究及PCR分子标记技术的发展为准确快速鉴别水稻典败型和染败型细胞质雄性不育系提供了有效的方法。本发明基于与水稻细胞质雄性不育系花粉败育相关的线粒体基因的研究，利用PCR技术对水稻典败型与染败型细胞质雄性不育系进行准确快速鉴别。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种实验条件和操作较为简单、样品用量少，能准确、快速鉴别水稻典败型和染败型细胞质雄性不育系的PCR方法，为生产上提供一种典败型和染败型细胞质雄性不育系鉴定的实用技术。
本发明的技术方案如下：
1.鉴别水稻典败型和染败型细胞质雄性不育系的特异引物，其特征在于：所述特异引物由3对引物atp6-orf79、orWA352和LD29组成；所述引物atp6-orf79由上游引物atp6-orf79F和下游引物atp6-orf79R组成，所述上游引物atp6-orf79F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物atp6-orf79R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1592bp；所述引物orWA352由上游引物orWA352F和下游引物orWA352R组成，所述上游引物orWA352F的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物orWA352R的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为1432bp；所述引物LD29由上游引物LD29F和下游引物LD29R组成，所述上游引物LD29F的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物LD29R的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为905bp或2555bp。
2.一种水稻典败型和染败型细胞质雄性不育系的PCR鉴别方法，特征在于包括以下步骤：
(1)从水稻细胞质雄性不育系材料提取总DNA样品，每个DNA样品分成三份，第一份用技术方案1中所述的引物atp6-orf79进行PCR反应，第二份用技术方案1中所述的引物orWA352进行PCR反应，第三份用技术方案1中所述的引物LD29进行PCR反应；
(2)PCR反应：
A.引物atp6-orf79对每个DNA样品的PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL，20pmol/L上游引物atp6-orf79F 0.25μL，20pmol/L下游引物atp6-orf79R 0.25μL，模板DNA 1μL，无菌双蒸水11μL，完成PCR反应后，放入Eppendorf PCR仪中，设置引物atp6-orf79的PCR扩增程序为：94℃预变性4min，循环内94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性2min，30个循环后72℃延伸10min；
B.引物orWA352对每个DNA样品的PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL，20pmol/L上游引物orWA352F 0.25μL，20pmol/L下游引物orWA352R 0.25μL，模板DNA 1μL，无菌双蒸水11μL，完成PCR反应后，放入Eppendorf PCR仪中，设置引物orWA352PCR扩增程序为：94℃预变性4min，循环内94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性1min30s，30个循环后72℃延伸10min；
C.引物LD29对每个DNA样品PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL，20pmol/L上游引物LD29F 0.25μL，20pmol/L下游引物LD29R 0.25μL，模板DNA 1μL，无菌双蒸水11μL，完成PCR反应后，放入Eppendorf PCR仪中，设置引物LD29的PCR扩增程序为：94℃预变性4min，循环内94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性3min，20个循环后72℃延伸10min；
(3)待上述3个PCR扩增完成后，同时各取5μL扩增产物，分别采用2％的琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色，在电压120V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照，电泳分离PCR扩增的产物，如果引物orWA352和引物LD29的PCR扩增产物分别为1432bp和2555bp的单一条带，且引物atp6-orf79无扩增条带，则确定所检材料为典败型水稻细胞质雄性不育系；如果引物atp6-orf79和LD29的PCR扩增产物分别为1592bp和905bp的单一条带，且引物orWA352为无扩增条带，则确定所检材料为染败型水稻细胞质雄性不育系。
与现有技术相比，本发明的创新点和有益效果是：
创新点：
(1)3对特异引物组合进行PCR提高鉴别的精确性；
(2)通过改变PCR的循环次数提高鉴别效果。
有益效果：
在水稻种子、苗期即可预期所检材料为可育/败育，是典败型败育还是染败型败育，不需等到水稻抽穗开花时期，在选育典败型和染败型不育系过程中可缩短育种年限，减少工作量，具有操作简单、准确、快速等优点。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是引物atp6-orf79的上游引物atp6-orf79F的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是引物atp6-orf79的下游引物atp6-orf79R的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是引物orWA352的上游引物orWA352F的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是引物orWA352的下游引物orWA352R的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：5所示的是引物LD29的上游引物LD29F的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：6所示的是引物LD29的下游引物LD29R的碱基序列。
附图说明
图1：水稻典败型和染败型细胞质雄性不育系PCR鉴别结果。图中泳道1-12为水稻细胞质雄性不育系，其中2、3、5、7、8、9、11和12为典败型不育系，1、4、6和10为染败型不育系。1-9分别为BT型(粳139A)、D型(D62A)、矮败型(矮败型合系42A)、滇Ⅰ型(滇Ⅰ型合系42A)、冈型(G46A)、红莲型(红莲型滇榆A)、印水型(印水型合系42A)、K型(K型辽207A)和野败型(野败型合系42A)细胞质雄性不育系，10-12分别为D-7/粳23A、滇屯502/H23A、IR58025/合系42A，均为新质源细胞质雄性不育系。M为DNA分子量标准。左侧为PCR引物名称，右侧标示PCR扩增条带的分子量大小。
具体实施方式
以下实施例无特殊说明为常规方法。
1、材料
所用材料如表1所示，
表1材料来源表
表1中所有供试材料已在如下非专利文献中公开，本专利申请人云南农业大学从申请日起二十年内向公众发放上述所有供试材料，云南农业大学地址：云南省昆明市盘龙区黑龙潭黑金路95号，邮编：650201。
1、粳139A公开文献：王先俱等，优质高产杂交粳稻新组合粳优558的选育与应用，杂交水稻，2012,27(4)：20-22。
2、D62A和G46A公开文献：廖金花等，籼型红米雄性不育系红宝石的选育及其特性，种子，2004,23(3)：14-16。
3、滇Ⅰ型合系42A公开文献：程贤宇等，滇Ⅰ型不育系合系42A高产繁殖技术，种子，2012(2)：122-123。
4、矮败型合系42A、红莲型滇榆A、印水型合系42A、K型辽207A、野败型合系42A公开文献：孙朝华等，不同细胞质源粳稻雄性不育系花粉败育特点研究，杂交水稻,2013,28(3):68-71。
5、D-7/粳23A、滇屯502/H23A、IR58025/合系42A公开文献：Wang SH et al.,Pollen abortive characters of new cytoplasmic male sterile lines and their potential heterosis in japonica Rice,Journal of Yunnan Agricultural University,2009,24(3):331-335。
2、DNA提取
采用改良的CTAB法(Rogers and Bendich,Extraction of DNA from milligram amounts of fresh,herbarium and mummified plant tissues,Plant Mol Biol,1985,5(2):69–76)提取水稻总DNA，取表1中12个水稻不育系嫩叶各约0.5g分别放入到已编号(编号同表1材料来源表)的1.5mL离心管中，每一材料的总DNA提取均按以下操作进行：
(1)取细胞质源水稻不育系嫩叶约0.5g放入到已编号的1.5mL离心管中，加入液氮并快速研磨成粉末状，待液氮挥发完毕后加入2×CTAB缓冲液700μL，放入65℃水浴锅中1h，每隔20min混匀一次。
(2)取出离心管，10000×g，离心10min。取上清液至已编号(编号同表1材料来源表)的1.5mL新离心管。
(3)在上清液中加入700μL氯仿异戊醇混合液(三氯甲烷：异戊醇(v/v)＝24:1)，颠倒混匀至分层明显。10000×g，离心10min，取600μl上清液移至已编号(编号同表1材料来源表)的1.5mL新离心管。
(4)重复步骤(3)。
(5)在上清液中加入等体积预冷的异丙醇。将离心管轻轻颠倒混匀约1min后，-20℃冰箱中沉降1h。
(6)取出后10000×g，离心10min。弃上清液，用70％乙醇洗涤后再用95％乙醇洗涤。
(7)37℃烘干至无酒精，加100μL已灭菌的双蒸水，现用或-20℃冰箱保存。
提总DNA过程大约需3h。
3、PCR扩增
(1)引物序列设计
根据对水稻细胞质雄性不育系花粉败育相关的线粒体基因的研究文献选取引物。atp6-orf79和LD29来自文献(Luan et al.,Mitochondrial DNA genetic polymorphism in thirteen rice cytoplasmic male sterile lines,Plant Cell Rep,2013，32(4):545–554)；orWA352来自文献(Luo et al.,A detrimental mitochondrial-nuclear interaction causes cytoplasmic male sterility in rice,Nat Genet,2013，45:573–577)。全部引物由华大基因(BGI)合成。将表1中12个水稻不育系的每个DNA样品等量分成三份，第一份用引物atp6-orf79进行PCR反应，第二份用引物orWA352进行PCR反应，第三份用引物LD29进行PCR反应；
(2)PCR反应：
A.引物atp6-orf79分别对表1中12个水稻不育系的每个DNA样品的PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL(购自北京博迈德公司)，20pmol/L上游引物atp6-orf79F 0.25μL，20pmol/L下游引物atp6-orf79R0.25μL，模板DNA 1μL，无菌双蒸水11μL；按照上述配制完成PCR反应后，将PCR管放入Eppendorf PCR仪中，设置引物atp6-orf79的PCR反应程序进行如下反应：94℃预变性4min，循环内94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性2min，30个循环后72℃延伸10min，耗时104min(每次可同时检测96个样品)，所述上游引物atp6-orf79F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物atp6-orf79R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，目标产物片段长度为1592bp。
B.引物orWA352分别对表1中12个水稻不育系的每个DNA样品PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL(购自北京博迈德公司)，20pmol/L上游引物orWA352F 0.25μL，20pmol/L下游引物orWA352R0.25μL，模板DNA 1μL，无菌双蒸水11μL；按照上述配制完成PCR反应后，将PCR管放入Eppendorf PCR仪中，设置引物orWA352的PCR扩增程序进行如下反应：94℃预变性4min，循环内94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性1min30s，30个循环后72℃延伸10min，完成引物orWA352一次PCR(每次可同时检测96个样品)共耗时89min，所述上游引物orWA352F的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物orWA352R的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，目标产物片段长度为1432bp。
C.引物LD29分别对表1中12个水稻不育系的每个DNA样品PCR扩增反应体系总体积均为25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL(购自北京博迈德公司)，20pmol/L上游引物LD29F 0.25μL，20pmol/L下游引物LD29R 0.25μL，模板DNA 1μL，无菌双蒸水11μL；按照上述配制完成PCR反应后，将PCR管放入Eppendorf PCR仪中，设置引物LD29的PCR扩增程序进行如下反应：94℃预变性4min，循环内94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性3min，20个循环后72℃延伸10min，耗时94min(每次可同时检测96个样品)，所述上游引物LD29F的碱基序列序列表如SEQ ID NO：5所示，下游引物LD29R的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，目标产物片段长度为905bp或2555bp。
(3)待上述12个水稻不育系的各PCR反应完成后，各取5μLPCR扩增产物，分别采用2％的琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭(EB)染色，在电压120V下电泳30min，凝胶成像系统下观察并拍照。
(4)特异引物在水稻典败型和染败型细胞质雄性不育系的电泳结果如图1，结果可见，典败型不育系中(泳道2、3、5、7、8、9、11、12)，引物orWA352和LD29分别扩增出1432bp和2555bp的单一条带，且引物atp6-orf79无条带。染败不育系中(泳道1、4、6、10)，atp6-orf79和LD29分别扩增出1592bp和905bp的单一条带，且引物orWA352无条带。表明本方法能在水稻的幼苗时期就将典败型与染败型水稻细胞质雄性不育系准确的鉴别出来。
整个鉴别过程(可同时鉴别96个样品)耗时约8-9h，如果3台PCR仪同时进行则约4-5h。
<110> 云南农业大学
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