本发明涉及一种转基因作物的检测方法，具体涉及抗草甘膦玉米MY68外源基因整合事件的外源插入载体(p35S-2300-2MG2EPSPS)右边界旁侧序列及其在玉米MY68检测中的应用。
背景技术：
“事件特异性检测”是一种检测转基因产品的方法，是根据外源插入载体序列以及其边界旁侧序列而建立的PCR检测技术，因此具有高特异性，将成为未来检测策略的重点。
事件特异性检测方法是以外源基因侧翼序列为基础而建立的，因此分离外源插入载体插入位点的旁侧序列已成为研究的重点。迄今为止，该领域已发展了一些基于PCR技术的侧翼序列的分离克隆方法，如质粒拯救方法、热不对称交错PCR(ThermalasymmetricPCR，TAIL-PCR)、反向PCR(InversePCR,IPCR)和PCR-Walking等。其中Hi-TAIL-PCR是由Liu等首创并逐步完善,是通过简并引物扩增出侧翼序列的典型方法。
四川省西南科技大学生命科学与工程学院分子重点实验室成功构建玉米叶片特异性表达的抗草甘膦基因2mG2-epspsp35S-2300-2MG2EPSPS表达载体，并通过农杆菌介导法转入玉米自交系Hill，获得转基因高抗草甘膦玉米品系MY68。
现有技术并没有报道关于抗草甘膦玉米MY68事件外源基因插入载体(p35S-2300-2MG2EPSPS)的右边界旁侧序列，也未见基于此特征序列建立的事件特异性PCR检测的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是，提供一种转基因抗草甘膦玉米MY68外源基因整合事件的外源插入载体(p35S-2300-2MG2EPSPS)右边界旁侧序列，并依据该旁侧序列建立转化体特异性定性PCR检测方法，能准确地鉴定出转基因抗草甘膦玉米MY68。
本发明是这样实现的：
1、本发明以抗草甘膦玉米MY68事件为材料，利用Hi-TAIL-PCR技术，经过3轮PCR扩增获得MY68事件外源插入载体右边界旁侧序列，该序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列总长度1087bp；
其中，第1-690bp来源于外源插入载体T-DNA右边界，第691-1087bp来源于与T-DNA右边界相连的玉米基因组序列。该玉米基因组序列碱基组成特征：G+C含量为34.2％，A+T含量为65.8％。
2、应用上述SEQ ID NO.1，本发明还提供了一种抗草甘膦玉米MY68事件特异性定性PCR检测方法。以多种常规玉米、转基因玉米和其它转基因植物基因组DNA为模板，利用MY68事件外源插入载体右边界旁侧序列设计特异性引物组合RBF/RBR、进行PCR扩增。
所述引物组合的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
本发明应用本发明提供的事件外源插入右边界旁侧序列，分别对多种常规玉米、转基因玉米和其它转基因植物进行了检测，以上所述检测所用的实验对象品种如下：
1)常规玉米：吉单180、吉东26、沈玉21、郁青281；
2)转基因玉米：玉米T4-1-1、GA21、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、MON863、MON89034、MIR604；
3)其它转基因植物：水稻科丰6号、大豆356043、棉花MON1445和油菜MS1。
结果表明：
在众多检测对象中，只有转基因抗草甘膦玉米MY68可以扩增出大小为271bp的特征产物，而非转基因玉米则无此特异性产物(结果如图1所示)。证明此引物组合具有很好的特异性，适合于转基因抗草甘膦玉米MY68事件特异性检测。具体实验请详见实施例。本发明首次公开转基因抗草甘膦玉米MY68事件外源基因插入载体右边界旁侧序列，并确定了外源插入载体序列和玉米基因组序列的接合位点。
利用发现的上述序列特征，本发明建立了转基因抗草甘膦玉米MY68事件特异性定性PCR检测方法，具体操作如下：
步骤1：提取待检测植物的基因组DNA；
步骤2：依据SEQ ID No.1中1-690bp位序列设计正向引物，依据SEQ ID No.1中691-1087bp位序列设计反向引物；
步骤3：配制PCR反应体系，进行PCR扩增反应；
步骤4：将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，根据是否扩增出271bp的产物，判断被测样品是否为转基因抗草甘膦玉米MY68。
上述步骤2中，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
上述步骤3中，所述PCR反应体系包括以下组分：正向引物、反向引物、TaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer、dNTP、分别以多种常规玉米、转基因玉米和其它转基因植物基 因组DNA玉米基因组为DNA模板。
在一种实施方式中，所述PCR反应体系包括以下组分：10μM正向引物1μL、10μM反向引物1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5μL含Mg2+的10×PCRBuffer、2.5mmol/L的dNTP2.5μL、20ng/μL的所述玉米基因组DNA模板1μL，加灭菌蒸馏水补足体积至25μL。
上述步骤3中，PCR扩增反应的程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃，10min。
上述步骤4中，所述琼脂糖凝胶为质量百分数为1％的琼脂糖凝胶。
用本发明的方法检测了4种非转基因玉米、10种转基因玉米和水稻、大豆、棉花和油菜等转基因作物，实验证实，仅有转基因玉米MY68能扩增出大小为271bp的特征产物，而所有其他被测植物均不能扩增出此特异性产物。
表明：本发明建立的转基因抗草甘膦玉米MY68事件特异性定性PCR检测方法具有高度特异性，能够用于转基因抗草甘膦玉米MY68事件的特异性检测。
附图说明：
图1是转化体特异性检测方法实验结果的电泳图，图中：
M：SuperDNAMarker；1：空白对照；2：阴性对照Hill；3：MY68样品；
4～13：分别为样品1～样品10。
具体实施方式：
实施例1转基因抗草甘膦玉米MY68事件外源基因插入位点载体右边界旁侧序列的Hi-TAIL-PCR扩增
一、提取待检测植物样品的DNA：采用普通CTAB法提取样品DNA，具体操作过程按农业部1485号公告-4-2010，转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化实施。其中植物样品包括转基因玉米MY68和非转基因玉米Hill。
二、通过Hi-TAIL-PCR获得外源插入基因右边界旁侧序列
(1)根据外源基因序列2MG2-EPSPS，设计Hi-TAIL-PCR扩增的特异性嵌套引物：
SpA1-1：GACGTGTGGACCAGAATCGTCAGGCAAG(SEQ ID No.4)
SpA1-2：ACGATGGACTCCAGTTCCCACTCTTCTTCAATCCCCACGACGAC(SEQ ID No.5)
SpA1-3：ATTGCAGATTCTGCTAACTTGCGCCAT(SEQ ID No.6)
(2)随机引物
AD1-1：ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA(SEQ ID No.7)
AD1-2：ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT(SEQ ID No.8)
AD1-3：ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA(SEQ ID No.9)
AD1-4：ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNAGGT(SEQ ID No.10)
AD-C：ACGATGGACTCCAGAG(SEQ ID No.11)
注：N＝A、T、C或G；V＝G、C或A；B＝G、C或T；B＝G、A或T
(3)Hi-TAIL-PCR扩增方法
第一轮Hi-TAIL-PCR反应：基因组DNA经OD测定准确定量后，取适量作为模板，以AD1-1为下游引物SPA1-1为上游引物，进行第一轮PCR反应。
按下列组份配制第一轮PCR反应液。
表1Hi-TAIL-PCR第一轮反应体系
第一轮Hi-TAIL-PCR反应条件如下：
第二轮Hi-TAIL-PCR反应：将第二轮PCR反应液取1μl作为第二轮Hi-TAIL-PCR反应的模板，以AD1-1Primer为上游引物，SPA1-2为下游引物，进行第二轮Hi-TAIL-PCR反应。
表2Hi-TAIL-PCR第二轮反应体系
第二轮PCR反应条件如下：
第三轮Hi-TAIL-PCR反应：取第二轮Hi-TAIL-PCR反应产物1μl作为第三轮Hi-TAIL-PCR反应的模板，以AD1-1为上游引物，SPA1-3为下游引物，进行第三轮Hi-TAIL-PCR反应。
按下列组份配制第三轮Hi-TAIL-PCR反应液。
表3Hi-TAIL-PCR第三轮反应体系
第三轮Hi-TAIL-PCR反应条件如下：
取第二轮，第三轮Hi-TAIL-PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。比较第2、3轮扩增产物，依据嵌套引物特点，选择第3轮扩增产物中大小与预期结果相符的条带，回收、克隆并测序。
(4)第3轮Hi-TAIL-PCR产物胶回收；Hi-TAIL-PCR产物用OMEGA公司胶回收试剂盒进行回收，具体操作步骤详见说明书。
(5)第3轮Hi-TAIL-PCR产物克隆
将Hi-TAIL-PCR产物和pGEM-TEasy载体相连，连接混合液中加入外源片段和载体的摩尔比约为3：1，连接反应体系如下：
表4连接反应体系
轻轻混合后，16℃下过夜反应。
(6)转化
a)将购买的感受态细胞(Trans109)放置冰上等待融化；
b)取10μL连接产物于50μL感受态细胞中，轻轻旋转以混匀液体，冰上放置30min；
c)将含有混合物的离心管置于42℃水浴中热激60s，随后立马冰上放置5min；
d)超净工作台内，向离心管中加入800μLLB液体培养基，37℃，200rpm摇床震荡培养60min。
e)5,000g离心5min，吸去600μL上清，余下液体用移液器轻轻吹打混匀；
f)取混匀的菌液，用已经通过灭菌并恢复到室温的涂布器涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养箱中培养16h。
g)检查转化菌落。
(7)阳性转化子的筛选
用蓝白斑筛选方法，初步对转化子筛选，然后挑取可能为阳性转化子的白斑，通过酶切方法做进一步鉴定。挑取阳性单菌落，放入含有氨苄的液体培养基中37℃过夜培养。用全式金公司质粒提取试剂盒提取上述菌液的质粒DNA，具体操作步骤详见说明书。使 用EcoRI酶对质粒DNA进行双酶切验证，酶切体系如下：
表5酶切反应体系
然后轻轻混匀后，37℃金属浴3小时。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(8)序列分析
筛选出阳性重组子克隆送上海英俊公司测序。手工去除pGEM-TEasy克隆载体序列后，通过NCBI网站进行序列比对分析和载体序列扫描，分析出MY68事件T-DNA右边界序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，确定插入载体与玉米基因组的整合位点，明确右边界旁侧序列中玉米基因组序列长度和碱基组成特点。
实施例2用本发明提供的旁侧序列对转基因抗草甘膦玉米MY68进行事件特异性定性PCR检测
一、根据核酸序列SEQ ID No.1设计一对MY68事件特异性定性PCR检测引物，并送华大基因公司合成，引物序列如下：
RB-F：TATTTGAATCTTTGACTCCAT(SEQ ID No.2)
RB-R：ATAGTAATTGGAGGGTTAAA(SEQ ID No.3)
二、建立转基因抗草甘膦玉米MY68进行事件特异性定性PCR检测方法
(1)提取待检测植物样品的DNA：采用普通CTAB法提取样品DNA，具体操作过程按农业部1485号公告-4-2010，转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化实施。其中植物样品包括常规玉米Hill、吉单180、吉东26、沈玉21、郁青281和转基因玉米MY68、GA21、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、MON863、MON89034、MIR604以及其它转基因植物(例如：水稻科丰6号、大豆356043、棉花MON1445和油菜MS1)等。并且实验材料制备如下：
样品1：非转基因玉米吉单180、吉东26、沈玉21、郁青281，等量混合制成一个样品。
样品2：水稻阴性。
样品3：大豆阴性。
样品4：棉花阴性。
样品5：油菜阴性。
样品6：转基因玉米GA21、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、MON863、MON89034、MIR604，混合制成1个样品，含量各5％。
样品7：转基因水稻科丰6号、克螟稻、M12、TT51，混合制成一个样品，含量各5％。
样品8：转基因大豆356043、305423、CV127、MON89788、A2704-12、GTS40-3-2，混合制成1个样品，含量各5％。
样品9：转基因棉花MON1445、MON88913、LLCOTTON25、MON15985，混合制成1个样品，含量各5％。
样品10：转基因油菜MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235，混合制成1个样品，含量各5％。
以上实验材料由绵阳农科院提供
(2)以上述基因组DNA为模板，分别用上述引物对进行PCR扩增。按照以下反应程序和体系进行PCR扩增：所述反应体系包括以下组分：10μM的所述正向引物1μL、10μM的所述反向引物1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.25μL、2.5μL含Mg2+的10×PCRBuffer、2.5mmol/L的dNTP2.5μL、20ng/μL的所述玉米基因组DNA模板1μL，加灭菌蒸馏水补足体积至25μL。所述PCR扩增反应的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃，10min。
(3)PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后，鉴定是否存在扩增产物，理论上引物RBF/BR扩增产物大小为：271bp。
实验结果
(1)转基因抗草甘膦玉米MY68事件外源插入载体右边界旁侧序列的Hi-TAIL-PCR扩增与测序分析。以转基因抗草甘膦玉米MY68基因组DNA为模板，通过Hi-TAIL-PCR的3轮扩增，获得一大小约1200的扩增产物，经过克隆、测序，及人工剔除克隆载体pGEM-TEasy序列后，获得大小为1084bp的序列。在NCBI网站上进行Blast和rescreen分析，确定其中690bp与插入载体右边界序列高度同源。进一步与插入载体右边界序列比对分析，发现在MY68转基因事件中，其插入载体右边界序列部分缺失。691-1084bp为玉米基因组序列高度同源。经过分析，该段玉米基因组序列的碱基组成富含A/T，其中：G+C含量为34.2％，A+T含量为65.8％。具体转基因抗草甘膦玉米MY68事件外源插入载体右边界旁侧序列见序列SEQ ID NO.1。
上述分析显示的序列包含转基因抗草甘膦玉米MY68事件外源插入载体右边界序列特点，其结合位点特征序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)利用本发明所提供的右边界旁侧序列设计转基因抗草甘膦玉米MY68事件特异性定性PCR检测方法。依据获得的MY68事件外源插入载体右边界旁侧序列设计特异性的巢式PCR引物：RB-F、RB-R。以常规玉米吉单Hill、180、吉东26、沈玉21、郁青281和转基因玉米MY68、GA21、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、MON863、MON89034、MIR604以及其它转基因植物(例如：水稻科丰6号、大豆356043、棉花MON1445和油菜MS1等)基因组DNA为模板，利用MY68事件外源插入载体右边界旁侧序列特异性引物组合RB-F/RB-R进行PCR扩增，结果如图1所示。只有转基因抗草甘膦玉米MY68可以扩增出大小为271bp的产物，而其他材料则无此特异性产物。
因此，可以认为此引物组合具有很好的特异性，适合于转基因抗草甘膦玉米MY68事件特异性检测。