一种基于微量量热法快速测定蛋壳表面菌落总数的方法与流程

本发明涉及菌落总数的检测方法，尤其是一种基于微量量热法快速测定蛋壳表面菌落总数的方法。

背景技术：

我国是世界上的禽蛋生产和消费大国，蛋品及蛋品加工产业是我国重要基础产业。然而与欧美国家相比我国蛋品加工程度低，蛋品原料质量参差不齐。蛋壳表面菌落总数是蛋品质量安全的一项重要指标，建立快速、灵敏度高的检测方法是构建蛋品质量安全体系，促进蛋品及蛋品加工业快速良好发展的关键，对提高蛋品质量、避免经济损失、促进我国蛋品出口等方面具有经济上和政治上的重要意义。

微量量热技术属于热分析，是仪器分析方法的一种。与其他快速检测技术相比，微量量热技术具有简单性、无损性和实时监测性。该技术对待测样品的理化性质无特殊要求，可不做或仅做简单的前处理即可，可以对样品反应过程进行高灵敏度的热效应测定，并可实时记录，因为微生物生长过程中无时无刻不伴随着热效应，且热效应与微生物的一些重要参数如菌数、生长速率、代时等有密切关系，因此该法在食品微生物检测中有广阔的应用前景。目前还没有关于利用微量量热技术测定鸡蛋壳表面菌落总数的方法报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于微量量热法快速测定蛋壳表面菌落总数的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种基于微量量热法快速测定蛋壳表面菌落总数的方法，包括以下步骤：

1)收集蛋壳表面微生物，并分离划线纯培养，提取细菌单菌落基因组，经PCR扩增后测序，鉴定得到蛋壳表面微生物种类和比例，筛选出优势菌株；

2)通过TAM III多通道微量量热仪中的静态等温安瓿实验测定蛋壳优势菌株的量热图谱，选择能比较好地代表蛋壳清洗液放热变化的菌株作为蛋壳清洗液的模式菌株；

3)采用量热培养基对模式菌株进行培养；

4)测定已知浓度的模式菌株和空白对照的热图谱，算出在扣除空白对照后的各标准菌溶液的总放热量，绘制总放热量-初始菌浓度标准曲线；

5)根据该标准曲线通过微量量热法测定待测样品的总放热量即可快速获取待测样品中的菌落总数。

优选地，所述量热培养基含有以下成分：营养肉汤15～20g/L、葡萄糖2～12g/L、甘露醇2～6g/L、麦芽糖2～6g/L、磷酸二氢钾2～6g/L、酵母浸粉10～30g/L、胰蛋白胨10～30g/L。

进一步优选地，所述量热培养基含有以下成分：营养肉汤18g/L、葡萄糖2g/L、甘露醇4g/L、麦芽糖4g/L、磷酸二氢钾2g/L、酵母浸粉10g/L、胰蛋白胨10g/L。

本发明的有益效果是：本发明能快速检测蛋壳表面的菌落总数，具有方法简单，灵敏度高，样品前处理简单，样品无损等优点。

附图说明

图1是鸡蛋蛋壳优势菌株构成，其中K01为葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)占55％；K02为芽胞杆菌属(Bacillus spp.)占21％；K03为微球菌属(Micrococcus spp.)占6％；K04为巨球菌属(Macrococcus spp.)占5％；other为其他比例较少的几种属一起，占13％。

图2是不同菌株的量热图谱，其中a为葡萄球菌、b为蛋壳清洗液、c为沙门氏菌、d为芽胞杆菌。

图3是不同碳源对模式菌株生长量的影响，其中C1为葡萄糖；C2为果糖；C3为α-乳糖；C4为麦芽糖；C5为蔗糖；C6为甘露醇；NB为不额外添加碳源的营养肉汤。

图4是不同氮源对模式菌株生长量的影响，其中N1为蛋白胨；N2为胰蛋白胨；N3为酵母浸粉；N4为硫酸铵；N5为硝酸铵；N6为氯化铵；N7为尿素；NB为不额外添加碳源的营养肉汤。

图5是L18混合3-6水平田口设计均值响应图，图中，葡萄糖对菌体生长量的影响先随浓度增加而有所增加，随后则因浓度越大生长量反而变小；酵母膏、甘露醇和麦芽糖的影响先增大后减小；蛋白胨先略减小再增大；胰蛋白胨则是随浓度增大而对菌体生长促进作用越大，在试验设计的水平中未出现拐点。

图6是L9四因素三水平田口设计均值响应图，根据响应图所示最优培养基为在营养肉汤的基础上再额外添加2g/L葡萄糖，4g/L磷酸二氢钾，10g/L酵母浸粉，20g/L胰蛋白胨以及4g/L的甘露醇和4g/L的麦芽糖。

图7是不同装液量和初始菌浓度的量热图谱，其中1、2、3号接种量均为0.1mL，4为0.2mL，5为0.3mL；1号装液量为1mL，2和4号为2mL，3和5号为3mL。

图8是不同培养基条件下的量热图谱，其中a为优化培养基A，即培养基配比为：18g/L营养肉汤，2g/L葡萄糖，4g/L磷酸二氢钾，10g/L酵母浸粉，20g/L胰蛋白胨，4g/L的甘露醇和4g/L的麦芽糖；b为优化培养基B，即培养基中磷酸二氢钾为2g/L，胰蛋白胨为10g/L其余配方与优化培养基一致；c为18g/L营养肉汤。

图9是不同初始菌浓度模式菌株的量热图谱，其中a～e的初始菌浓度(cfu/mL)依次为3.53×10⁶、1.76×10⁶、3.53×10⁵、1.75×10⁵、3.53×10⁴。

图10是初始菌浓度与总热量、热量和菌落总数的拟合曲线，其中(a)为总热量-初始菌浓度标准曲线；(b)为热流-初始菌浓度标准曲线；(c)为最终菌落总数-初始菌浓度标准曲线，且其中初始菌浓度-总热量标准曲线方程为：y＝1.05x-150.38R2＝0.993>0.990。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

1.蛋壳表面微生物模式菌株的筛选

通过收集鸡蛋壳表面微生物，并进行纯培养得到菌株305株，根据菌株在营养琼脂平板上菌落形态差异去除重复后，提取细菌单菌落基因组DNA，经PCR扩增后并测序，鉴定得到蛋壳表面微生物菌株所占比例最大的两个属为葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)所占比例最大为55％，其次为芽胞杆菌属(Bacillus spp.)所占比例为21％(图1)，选取葡萄球菌、芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteric)、蛋壳清洗液、空白对照进行了量热图谱的测定(图2)。图2结果表明葡萄球菌可以很好的代表鸡蛋壳清洗液的放热变化，确定了葡萄球菌作为鸡蛋壳清洗液的模拟菌株进行实验研究。

蛋壳表面微生物模拟菌株的筛选详细方法和步骤是：

1.1蛋壳表面菌株的收集和鉴定

取鸡蛋样品，用两根灭菌棉签蘸取1mL无菌生理盐水仔细擦拭蛋壳表面后将棉签头折断置入10mL离心管中，再用一根干的灭菌棉签擦拭蛋壳表面残留擦拭液后折断置入同一离心管中，再加入2mL灭菌生理盐水，使用涡轮微振荡器，振荡30s后收集擦拭液，重复操作再次收集擦拭液。对蛋壳清洗液适度稀释后，使用涂布平板法分离蛋壳表面微生物。37℃倒置培养24h后，选择合适菌落数(30～300)/个的涂布平板，根据菌落特征和菌体形态学特征，对细菌单菌落初步分类。将挑选出的菌株依次做好标记和记录，并用平板划线法再次分离纯化3次。用半固体保存纯化得到的菌株，37℃过夜培养后置于4℃冷藏保存，以备测序鉴定。使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌单菌落基因组DNA，经PCR扩增后进行1％琼脂糖凝胶(E×Red核酸染料染胶)电泳检测，选择电泳条带明亮的大小约为1500bp的扩增产物进行测序，将测序结果输入NCBI数据库对比，综合分析得到菌种鉴定结果，统计分析得到菌种分布比例结果(图1)。

1.2利用微量量热技术进一步筛选出模式菌株

取稀释至104cfu/mL的三种蛋壳优势菌(本实施例中为葡萄球菌(Staphylococcus equorum)和芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteric))种子液各2mL分别加入灭过菌的金属安瓿瓶中；取2mL蛋壳清洗液加入安瓿瓶中；取2mL灭菌营养肉汤加入安瓿瓶中作为空白对照。每次一共5个样品，使用TAM III多通道微量量热仪(美国TA仪器公司)中的静态等温安瓿实验(IMC)测定蛋壳优势菌量热图谱，测量条件为，温度28℃，接种量0.1～0.2mL，总装液体积为1～3mL，测定前基线调整15min，加样测定热平衡时间15min，图谱测定时间10～12h。经量热图谱的测定后发现，葡萄球菌的生长热图谱可以比较好的代表鸡蛋壳清洗液的放热变化，而芽胞杆菌和沙门氏菌与蛋壳清洗液的放热图谱间差异较大，因此后续实验中选用葡萄球菌作为鸡蛋壳清洗液的代表模式菌株(图2)。

2.优化培养基和量热条件的确定

通过单因素实验、田口试验设计对模式菌株的培养基进行了优化研究(图3、图4、图5、图6)。考察了不同接种浓度和装液量对量热结果的影响(图7)，并使用量热法测定验证了优化结果(图8)。最后确定最佳培养基条件为：18g/L营养肉汤、2g/L葡萄糖、2g/L磷酸二氢钾、10g/L酵母浸粉、10g/L胰蛋白胨、4g/L甘露醇、4g/L的麦芽糖，按比例称取并使用蒸馏水配制，将配制的培养基，于121℃灭菌30min待用。

接种量为0.2mL，总装液量为2mL。

优化后总放热量提高了31.24％；热流提高了118.20％；菌生长量提高了88.18％。

3.热效应-初始菌浓度标准曲线的确定

取葡萄球菌划线平板以无菌操作挑取1环单菌落，接入营养肉汤培养液中，培养温度为37℃，摇床转速为120r/min过夜培养作种子液。检测种子液OD₆₀₀值，将吸光度调整至0.17，即根据所得吸光度-葡萄球菌菌浓度标准曲线算出葡萄球菌菌浓度为7.5×10⁶cfu/mL，再进行梯度稀释。使用量热仪测量不同初始浓度的模拟菌株微量量热图谱(图9)。并用倾注法检测初始菌浓度和量热结束后菌浓度，与量热图谱数据进行整合分析(图10)。

其中初始菌浓度-总放热量拟合的方程为：y＝1.05x-150.38R²＝0.993>0.990；初始菌浓度-热流拟合方程为：y＝4.47x-113.12R²＝0.960<0.990；初始菌浓度-菌落总数拟合方程为：y＝2.47x-13.15R²＝0.990≥0.990。由于总放热量是对整个量热曲线进行积分算得，可以更好的反映模拟菌株的整体生长过程，比量热结束时的单一时刻所得热流变化的稳定性更高，因此选取测定总放热量根据所得标准曲线算得菌落总数。

利用微量量热法仅需10～12h，即可获得菌落总数的值，所需时间远远小于传统倾注培养计数法(需要24～48h)。当然，只要收集到相应优势菌株，按照本发明相同的方法同样可以快速检测其它禽蛋蛋壳样品中的菌落总数。