本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及鉴定多花多粒小麦-冰草渐渗系的SNP分子标记及其应用。
背景技术：
：小麦是世界主要粮食作物之一，然而，在长期的驯化及栽培过程中遗传多样性逐渐降低，这严重阻碍了小麦新品种的培育。因此，提高小麦的遗传多样性变得尤为重要。小麦野生近缘种长期生长在自然环境中，经受了各种恶劣环境条件的考验，蕴藏着丰富的遗传变异，携带有大量价值的基因资源可供小麦利用。把这些优异基因引入普通小麦是增加小麦遗传多样性和改良小麦品种的重要途径。冰草属(AgropyronGaertn.)是小麦重要的野生近缘属，由单一P基因组构成，具有众多可用于小麦改良的优异基因。李立会等通过胚拯救的方法获得了普通小麦‘Fukuhokomugi’与冰草Z559的杂种，之后通过自交和连续回交创制了一系列小麦-冰草异源二体附加系。目前，利用小麦-冰草附加系产生易位系，已经将6P染色体的多花多粒、抗白粉病和叶锈病、多分蘖和高千粒重以及2P染色体的抗白粉病等优异性状导入普通小麦，并获得了大量携带P基因组遗传特征的疑似渐渗系。尽管许多外源基因已经被导入小麦中，但是基因的渗入仍然费时费力，很难满足小麦育种的需求。因此，对已经获得的渐渗系的有效检测是加速外源种质利用过程中迫切需要解决的问题。一直以来，细胞学手段，比如染色体带、GISH和FISH，被广泛用来检测小麦中的外源染色体片段。但是这些传统技术分辨率较低，且不能高通量检测杂交后代。普通分子标记，例如SSR，能够检测小麦中细胞学方法无法检测到的小片段外源染色质，但是在高通量检测时它们费力耗材，这严重限制了它们在小麦育种中的应用。SNP即单核苷酸多态性，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记。SNP标记是第三代分子标记技术，相对传统的RFLP、SSR标记等具有在基因组中遗传稳定、数量多、位点专一、易检测、更适合于高通量的检测分析等优点。Tiwari等首次利用卵穗山羊草5MgS特异的SNP标记检测小麦背景下卵穗山羊草染色质的渗入。我们的前期研究表明，通过对四倍体冰草转录组测序发现，冰草与小麦转录本存在大量高相似性序列，相似度峰值达到98％，这为冰草特异SNP标记的开发奠定了基础。技术实现要素：本研究首次大规模开发冰草P基因组特异的SNP标记，并试图将其应用于小麦-冰草渐渗系中的P基因组遗传成分或功能基因的有效检测。为了有效检测小麦-冰草渐渗系中的P基因组遗传成分，本研究利用冰草转录组数据获得冰草P基因组相对于小麦ABD基因组特异的SNP位点176,135个，并选择在功能注释上与多花多粒、抗病和抗逆等性状相关的230个P基因组SNP位点，以小麦品种Fukuhokomugi、中国春、周麦18、藁城8901和冰草Z559、18个小麦-冰草附加系和89份疑似渐渗系为材料，利用KASP(CompetitiveAlleleSpecificPCR)技术进行了基因分型检测与验证。结果显示，其中70个SNP标记可有效应用于P基因组遗传成分检测，并将56个SNP标记定位于不同的P染色体上。对89份疑似渐渗系材料进一步分析发现，6个P基因组SNP标记分别在不同材料得到验证，涉及功能域包含Mybfamilytranscriptionfactor和NB-ARC的基因，证实了其为小麦-冰草渐渗系。本发明提供用于鉴定多花多粒小麦-冰草渐渗系的SNP分子标记，所述SNP分子标记为Unigene20307-1420，以冰草Unigene20307基因第1420bp处为目标(冰草此处碱基为G，普通小麦此处碱基为A)，用于KASP技术扩增后基因分型呈现杂合型为多花多粒小麦-冰草渐渗系。本发明还有一个目的在于提供所述用于鉴定多花多粒小麦-冰草渐渗系的SNP分子标记在检测小麦-冰草渐渗系基因型中的应用。本发明还提供以所述用于鉴定多花多粒小麦-冰草渐渗系的SNP分子标记检测多花多粒的小麦-渐渗系的方法，其为以SNP分子标记Unigene20307-1420检测待测植株，基因分型呈现杂合型为多花多粒的小麦-渐渗系。所述以所述用于鉴定多花多粒小麦-冰草渐渗系的SNP分子标记检测多花多粒小麦-冰草渐渗系的方法在小麦育种中的应用。本发明还提供以Unigene20307-1420的SNP分子标记检测多花多粒小麦-冰草渐渗系在选育多花多粒的小麦品种中的应用。本发明还提供针对SNP位点Unigene20307-1420设计的特异性引物，其核苷酸序列为：标有VIC的等位型1引物：atccacgaaaagcagttcccgc，如SEQIDNo.1所示；标有FAM的等位型2引物：gatccacgaaaagcagttcccgt，如SEQIDNo.2所示；通用引物：gagagggagcagctccatcactt，如SEQIDNo.3所示。本发明还提供针对SNP位点Unigene20307-1420设计的特异性引物在选育优良小麦品种中的应用。本发明首次基于SNP标记技术开发了在小麦背景下的冰草P基因组特异分子标记，为高通量检测和追踪小麦-冰草衍生后代中的冰草外源遗传成分提供了一个有效的方法，且以此标记成功地鉴定出携带多花多粒优异性状的小麦-冰草渐渗系，对未来小麦育种中有效利用这些冰草外源基因奠定了重要基础。附图说明图1实施例1中KASP引物的分型检测。其中，a为KASP引物在普通小麦中国春、Fukuhokomugi和冰草中成功分型；b为SNP标记unigene60281_All-294定位在小麦-冰草附加系4844-12、5113、5114和II-30-5中；c为SNP标记unigene20217_All-182定位在小麦-冰草渐渗系材料中。具体实施方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。小麦品种‘Fukuhokomugi’、中国春、藁城8901和周麦18均为公知品种。冰草品种Z559为公知品种。实施例1实验材料以原始杂交母本普通小麦品种‘Fukuhokomugi’(Triticumaestivum2n＝6x＝42，AABBDD)和父本冰草Z559(Agropyroncristatum(L.)Gaertn.，2n＝4x＝28，PPPP)以及普通小麦中国春(ChineseSpring，CS)、藁城8901和周麦18为对照，用于P基因组特异SNP标记筛选。以18个小麦-冰草二体附加系(表2)(张艳，2013)为材料，用于P基因组特异SNP标记的染色体定位。89份小麦-冰草疑似渐渗系材料被用于检测其是否携带P基因组遗传成分或功能基因，渐渗系材料的详细系谱见表1。表1小麦-冰草附加系同源群归属注：W代表小麦染色体，P代表冰草染色体。实验方法小麦背景下冰草特异SNP的筛选基于四倍体冰草Z559转录组序列，以已经发表的中国春小麦基因组序列为引物，利用BWA/samtools进行冰草特异SNPcalling分析，筛选相识度高于95％，仅在冰草中特异的SNP位点，作为初步的冰草特异SNP。冰草转录组与中国春基因组数据均来源于NCBI。按照冰草转录组注释结果[参见ZhangJ,LiuW,HanH,SongL,BaiL,GaoZ,etal.DenovotranscriptomesequencingofAgropyroncristatumtoidentifyavailablegeneresourcesfortheenhancementofwheat.Genomics.2015；106(2):129-36]，选择P基因组中与多花多粒、抗病和抗逆等性状相关的基因进行KASP技术的实验验证。KASP引物设计将选择的SNP位点及侧翼序列各50bp发送给LGC公司来设计KASP引物(图1)。KASP分型过程中，我们将小麦基因型作为等位型1(Allele1)，冰草基因型作为等位型2(Allele2)，以水为空白对照。引物设计时将未标记的VICtail序列加在Allele1正向引物的5’端，将未标记的FAMtail序列加在Allele2正向引物的5’端，以此来区分不同的基因型。具体如下：标有VIC的等位型1引物：atccacgaaaagcagttcccgc，如SEQIDNo.1所示；标有FAM的等位型2引物：gatccacgaaaagcagttcccgt，如SEQIDNo.2所示；通用引物：gagagggagcagctccatcactt，如SEQIDNo.3所示。SNP分型KASP分型反应需要Mastermix、Assaymix和DNA模板。PCR反应采用96孔板，总体系10μL，包括5μLhighroxKASPmastermix，0.14μLprimermix，1μL基因组DNA(浓度为50ng/μL)和4μLH2O。实验在ABIStepOnePlusReal-TimePCR仪上进行(反应中以ROX作为内参)[SuZ,JinS,LuY,ZhangG,ChaoS,BaiG.SinglenucleotidepolymorphismtightlylinkedtoamajorQTLonchromosome7Aforbothkernellengthandkernelweightinwheat.MolecularBreeding.2016；36(2).]，荧光强度检测以及数据分析采用ABIStepOneSoftwarev2.1。PCR扩增程序为：94℃15min，接着为Touchdown程序94℃20s，61℃1min，每个循环降0.6度，共10个循环，然后94℃20s，55℃1min，共26个循环，在25℃下完成读板。实验结果基于小麦参照基因组的冰草SNPcalling分析冰草转录组测序结果拼接成73664条冰草unigenes序列(GenBank，GBAU00000000)，与小麦基因组序列进行比对获得29535条高相似度序列，并以小麦基因组序列作为引物进行SNPcalling分析寻找P基因组特异SNPs。在小麦ABD基因组中有相同基因型而在冰草中有不同基因型的SNPs是目标SNPs。经过比对，我们发现176,135个SNPs在小麦ABD中有相同基因型，而在冰草中为另一基因型。同时为了消除目标SNP侧翼序列变异带来的干扰，我们会选取SNP侧翼序列50bp在小麦ABD与冰草P基因组之间没有任何变异的SNP作为P基因组特异SNPs。根据小麦-冰草附加系以及渐渗系的多花多粒、抗病和抗逆的农艺性状，并结合Zhang等对冰草unigenes的功能注释，我们从中随机选择了可能与育性、抗病相关的230个SNP位点进行基因型分型检测与验证，包括花发育途径相关基因以及功能域包含AP2、Myb_DNA-binding和NB-ARC的基因(表2)。表2KASP引物筛选统计KASP实验筛选小麦背景下的冰草P基因组特异SNP我们对选取的226个SNPs在冰草、中国春、Fukuhokomugi进行了KASP分型实验检验。若目标SNP在普通小麦中国春与Fukuhokomugi中呈现相同基因型Allele1(在坐标系的左上方)，在冰草中为另一基因型Allele2(在坐标系的右下方)，而在普通小麦与与冰草的混合样品中呈现杂合型(图1a，在坐标系的对称轴位置)，则证明此SNP成功分型，并且为冰草特异标记，可以用来有效检测P基因组遗传成分。KASP结果显示，在226个SNP中，有66个SNP在普通小麦和冰草有不同的基因型(Allele1和Allele2)，在冰草与普通小麦的混合样中为杂合型(Allele1/Allele2)(图1a)，这说明这70个SNP为冰草P基因组特异SNP。这些KASP引物的分型成功率约29％。因此，这些SNP可用于鉴定小麦-冰草附加系、易位系以及渐渗系中的冰草P基因组遗传成分。P基因组特异SNP在小麦-冰草附加系中的定位为了将分型成功的66个SNPs进一步定位在小麦-冰草二体附加系中，确定其在冰草染色体上的定位和归属，我们完成了这些SNP标记在附加系中的筛选实验。若附加系材料含有目标SNP，则SNP在附加系材料中应呈现杂合型即Allele1/Allele2，即证实附加系中小麦与冰草染色体同时存在。SNP分型实验显示在分型成功的66对KASP引物中有52对引物在小麦-冰草附加系中得到验证。这52个SNPs在普通小麦中呈现Allele1，在冰草中呈现Allele2，而在小麦-冰草附加系中呈现杂合型，这证明附加系材料中含有目标SNP。根据SNP在小麦-冰草附加系中的分型情况，在这些SNP标记中有28个SNP定位在在附加系4844-12、5113、5114和II-30-5的6P染色体上(图1b)，9个SNP定位在在附加系II-26、II-5-1、5038和5043的7P染色体上，2个SNP标记定位在附加系II-4-2的7P染色体上，6个SNP标记定位在附加系II-21-2和II-21-6的4P染色体上，3个SNP标记定位在附加系II-11-1a的5P染色体上，1个SNP定位在附加系II-7-1、II-8-1、II-9-3的2P染色体上，另外3个SNP标记在同时在多个不同归属群的附加系材料中出现。以上结果显示，其中47个SNP标记定位的附加系材料的同源群归属与比对的小麦染色体位置一致，占90.4％，这进一步说明这些SNP标记在冰草与小麦之间相对保守。见表3。表3P基因组特异SNP在小麦-冰草附加系中的定位P基因组特异SNP在小麦-冰草渐渗系中的有效检测在小麦-冰草远缘杂交利用中，有一些高代疑似小麦-冰草渐渗系具有突出的冰草优异性状，如多花多粒、抗病等，但是利用常规的细胞遗传学技术如GISH和常规分子标记技术很难检出外源染色质。因此我们用SNP标记技术检测渐渗系中的冰草成分。我们将在附加系中检测到的52个SNP标记，对89份小麦-冰草渐渗系进行了筛选鉴定。结果显示在52个SNP标记中Unigene20307-1420在携带多花多粒优异性状的渐渗系材料中得到验证。这个SNP在小麦与冰草中为不同的基因型，在渐渗系材料中呈现杂合型(图1c)，进一步证实渐渗系中含有冰草遗传成分。Unigene20307-1420定位在渐渗系材料31485-31505中，这表明，我们分离鉴定的SNP标记可以有效检测远缘杂交后代中渗入的小片段遗传物质。同时，渐渗系31485-31505在每穗小穗数、小穗粒数和穗粒数上明显优于普通小麦Fukuhokomugi(表4)，这进一步暗示Unigene20307可能与冰草多花多粒相关。表4渐渗系材料31485-31505与Fukuhokomugi的性状比较品系每穗小穗数小穗粒数穗粒数31485-3150521.52±1.6a6.37±0.77a96.50±16.95bFukuhokomugi18.5±1.27c4.60±0.70a61.80±7.71b讨论小麦野生近缘种对于拓宽小麦遗传背景，改良小麦抵御生物与非生物胁迫具有巨大潜力。目前，小麦与小麦族23个属均杂交成功，已将100余个外源基因转入小麦。然而外源染色体片段导入小麦上通常会有不利基因伴随目的基因一起进入小麦中，造成连锁累赘。而且外源染色体片段越大，连锁累赘现象越严重，遗传上也会越不稳定。因此小麦-外源二体附加系和大片段易位系很难被直接应用于小麦生产实践中。随着染色体工程的发展，获得更小片段易位系和渐渗系成为减少遗传累赘的最佳途径，将更有利于转移与利用外源优异基因。因此，如何快速高效地检测小麦中渗入的外源染色质是一个迫切需要解决的问题。本研究中我们随机选择的226个SNP标记中70个证实冰草P基因组特异，其中52个SNP定位到冰草不同染色体上。同时，在52个SNP中Unigene20307-1420可以用于多花多粒小麦-冰草渐渗系的检测。本研究为检测小麦中的渗入的外源遗传物质提供了一个快速有效的方法。因此，本研究中的高通量检测多花多粒的小麦-渐渗系的方法是小麦育种进程中重要的一步。在创制易位系利用外源基因中，基因挖掘是相对困难的，因为外源染色体片段与小麦染色体间的不交换使常规的图位克隆正向遗传学方法很难行得通。然而，已经证明反向遗传学方法挖掘小麦野生近缘种的优异基因是一个有效的途径，例如Stpk-V(白粉病抗性基因Pm21的一个重要组分)。这里我们直接从转录基因，找出特异SNP，为快速挖掘外源染色体片段携带的优异基因提供了新的途径。本实验室通过远缘杂交创建了一系列小麦-冰草疑似渐渗系，与亲本相比部分材料具有多花多粒、抗白粉病、高千粒重等优良性状。本研究将SNP标记成功定位在小麦-冰草渐渗系中，证实了渐渗系中确实含有冰草P基因组遗传成分。而这些SNP标记只在部分具有多花多粒的渐渗系中检测到，说明冰草P染色体片段在调控多粒性方面具有重要作用。我们对渐渗系中定位的Unigene20307的结构与功能进行了深入挖掘，通过比对发现Unigene20307的转录组序列含有完整的编码框，进一步的蛋白比对结果显示Unigene20307编码的蛋白与山羊草、图小麦、水稻的SWI/SNF复合体单元SWI3B编码的蛋白极为相似，相似度分别是97％、89％、75％。对于SWI3复合蛋白，拟南芥中曾报道其与拟南芥花器官发育相关，AtSWI3突变会导致植株矮小、胚发生异常、育性降低。Unigene20307-1420定位的渐渗系材料31408-09和31485-31505具有的多花多粒表型，进一步暗示了Unigene20307可能与冰草育性相关，这对于利用此冰草基因提高小麦育性具有重要意义。本研究在定位在附加系中的56个冰草特异SNP中得到可有效检测多花多粒渐渗系的SNP，这为寻找与性状关联的功能基因奠定了基础，对于有目的的利用冰草基因资源具有重大意义。本研究首次大规模开发了冰草特异SNP标记，并有效应用于小麦-冰草附加系和渐渗系的检测，且获得与多花多粒相关的SNP标记，为有目标的高通量筛选衍生后代提供了强有力的技术支撑，同时这将有利于冰草功能基因的精细定位与克隆，实现了种质创新从染色体工程向分子染色体工程的技术转变。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。SEQUENCELISTING<110>中国农业科学院作物科学研究所<120>鉴定多花多粒小麦-冰草渐渗系的SNP分子标记及应用<130>KHP161118251.4Q<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1atccacgaaaagcagttcccgc22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2gatccacgaaaagcagttcccgt23<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3gagagggagcagctccatcactt23当前第1页1 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