专利名称：冰草成熟胚组织培养再生方法
技术领域：
本发明涉及一种冰草成熟胚组织培养再生方法，尤其是涉及一种冰草成熟胚诱导再生植株的培养方法。
背景技术：
我国的草地是全国面积最大的绿地生态系统，但主要处于西北边陲，大多属于干旱和半干旱地区，生态环境脆弱。近几十年来，由于过度放牧、不合理利用、滥垦滥伐等原因，致使草地‘三化’现象日趋严重。而这些地区可供开发利用的土地资源十分丰富，可利用抗旱抗盐碱性强的植物来改善这些地区的生态环境，提高土地利用率。由于大多数牧草生育周期较长，性状遗传较为复杂，用常规育种方法培育新品种难度较大；造成了我国牧草生产品种数量少、品质差，而且抗逆性水平程度均不高。如何能在短时间内培育出适合我国不同地域的高产、优质、抗逆性及抗病虫害特性优异的新品种便成为牧草育种一个急待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以有效提高冰草体细胞胚胎和芽发生频率的冰草成熟胚组织培养再生方法。
本发明的目的由如下技术方案实施其包括有如下步骤，(1)种子的选取及处理；(2)将成熟胚接种于愈伤诱导培养基上培养，(3)将愈伤诱导培养基培养的成熟胚转入继代培养基中培养；(4)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养；(5)待分化出小苗后转入生根培养基中生根；a、所述种子的选取及处理选取有生活力的饱满种子，将种子在室温下用水浸泡后，剥去内外稃，放到含有1.0mg/L-4.0mg/L 2，4-D的溶液中浸泡1.5小时-3.0小时，再消毒处理；所述愈伤诱导培养基MS基本培养基+0.1mol/L-0.5mol/L甘露醇+1mg/L-10mg/L 2，4-D+浓度为0.2％-1.5％AgNO3+质量百分比为2％-10％的蔗糖+质量百分比0.55％-0.85％琼脂，其中所述愈伤诱导培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌，使出愈。
本发明的优点在于可以促进愈伤组织的器官发生与体细胞胚胎的发生，提高出愈率；促进一些再生困难种芽的产生；增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频率。
图1为成熟胚组织培养再生方法的工艺流程图。
具体实施例方式实施例1冰草成熟胚组织培养再生方法包括有如下步骤，(1)种子的选取及处理选取有生活力的饱满种子，将种子在室温下用水浸泡2～4h后，剥去内外稃，放到含有1.0mg/L 2，4-D的溶液中浸泡1个半小时，然后在超净工作台上用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗至少3次后用0.2％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗至少3次；置于铺有湿无菌滤纸的培养皿中，用解剖针从盾片处挑出尽量少带胚乳的胚；在剥取胚时适当将胚夹破，接种在愈伤组织诱导培养基上，每皿接种50粒成熟胚；(2)将成熟胚接种于愈伤诱导培养基上培养，26℃暗培养14天，其中愈伤诱导培养基为MS基本培养基+0.1mol/L甘露醇+1mg/L2，4-D+浓度为0.2％AgNO3+质量百分比为2％的蔗糖+质量百分比0.55％琼脂，其中所述愈伤诱导培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌，使出愈。
(3)将愈伤诱导培养基培养的成熟胚转入继代培养基中培养20天，继代2～3次继代培养基MS+0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L 2，4-D+0.3mg/L水质状脱落酸ABA+质量百分比为2％的蔗糖+质量百分比0.55％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；(4)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养；其中分化培养基MS+3.0mg/L KT+1.0mg/L NAA+质量百分比为2％的蔗糖+质量百分比0.55％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；培养条件为26℃下16h光照培养，光照强度为3000～4000lx，每隔30天继代一次。
(5)待分化出小苗后转入生根培养基中生根，其中生根培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+质量百分比为2％的蔗糖+质量百分比0.55％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌。
实施例2冰草成熟胚组织培养再生方法包括有如下步骤，(1)种子的选取及处理，选取有生活力的饱满种子，将种子在室温下用水浸泡2～4h后，剥去内外稃，放到含有3.0mg/L 2，4-D的溶液中浸泡3个小时，然后在超净工作台上用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗至少3次后用30％的次氯酸钠消毒45min左右，再用无菌水冲洗至少3次；置于铺有湿无菌滤纸的培养皿中，用刀片将含有胚的部分切下，接种在愈伤组织诱导培养基上，每皿接种50粒成熟胚；(2)将成熟胚接种于愈伤诱导培养基上培养，26℃暗培养14天，其中愈伤诱导培养基为MS基本培养基+0.5mol/L甘露醇+10mg/L2，4-D+浓度为1.5％AgNO3+质量百分比为10％的蔗糖+质量百分比0.85％琼脂，其中所述愈伤诱导培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌，使出愈；(3)将愈伤诱导培养基培养的成熟胚转入继代培养基中培养20天，继代2～3次继代培养基MS+0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L2，4-D+0.6mg/L水质状脱落酸ABA+质量百分比为10％的蔗糖+质量百分比0.85％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；(4)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养；其中分化培养基MS+3.0mg/L KT+1.0mg/L NAA+质量百分比为10％的蔗糖+质量百分比0.85％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；培养条件为26℃下16h光照培养，光照强度为3000～4000lx，每隔30天继代一次。
(5)待分化出小苗后转入生根培养基中生根，其中生根培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+质量百分比为10％的蔗糖+质量百分比0.85％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌。
实施例3冰草成熟胚组织培养再生方法包括有如下步骤，(1)种子的选取及处理，选取有生活力的饱满种子，将种子在室温下用水浸泡2～4h后，剥去内外稃，放到含有2.0mg/L 2，4-D的溶液中浸泡2个小时，然后在超净工作台上用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗至少3次后用50％的次氯酸钠消毒25min左右，再用无菌水冲洗至少3次；置于铺有湿无菌滤纸的培养皿中，用解剖针从盾片处挑出尽量少带胚乳的胚；在剥取胚时适当将胚夹破，接种在愈伤组织诱导培养基上，每皿接种50粒成熟胚；(2)将成熟胚接种于愈伤诱导培养基上培养，26℃暗培养14天，其中愈伤诱导培养基为MS基本培养基+0.3mol/L甘露醇+5.5mg/L2，4-D+浓度为0.85％AgNO3+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比0.7％琼脂，其中所述愈伤诱导培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌，使出愈；(3)将愈伤诱导培养基培养的成熟胚转入继代培养基中培养20天，继代2～3次继代培养基MS+0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L2，4-D+0.6mg/L水质状脱落酸ABA+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比0.7％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；(4)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养；其中分化培养基MS+3.0mg/L KT+1.0mg/L NAA+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比0.7％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；培养条件为26℃下16h光照培养，光照强度为3000～4000lx，每隔30天继代一次。
(5)待分化出小苗后转入生根培养基中生根，其中生根培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比0.7％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌。
实施例4本发明和现有技术成熟胚诱导再生植株的培养的对比1.1实验材料(1)、本试验选用多年生冰草的4个品种的成熟种子为供试材料。按实施例1，实施例2，实施例3的冰草成熟胚组织培养再生方法培养，待分化出小苗后转入生根培养基中生根之后进行结果分析。
(2)、同时选取有生活力的饱满种子，如实施例1的方法处理，之后再在如下的培养条件下培养。
将成熟胚接种于愈伤组织诱导培养基上，26℃暗培养14天，然后转入继代培养基中培养20天，继代2～3次。挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基上进行分化，培养条件为26℃下16h光照培养，光照强度为3000～4000lx，每隔30天继代一次。待分化出小苗后转入生根培养基中生根。
其中愈伤诱导培养基为MS+甘露醇0.2mol/L+2，4-D2.0mg/L+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比0.7％琼脂，其中所述愈伤诱导培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；继代培养基MS+甘露醇0.2mol/L+2，4-D 2.0mg/L+6BA0.3mg/L+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比0.7％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；分化培养基MS+KT 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比0.7％琼脂，其中所述培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；生根培养基1/2MS+NAA 0.5mg/L+质量百分比为3％的蔗糖+质量百分比0.7％琼脂，其中培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌；按实施例1的方法培养，待分化出小苗后转入生根培养基中生根之后进行结果分析。
2、两种方法对冰草组培再生的影响(如下表)
从表中可以看出，把4种冰草接种在不同的愈伤诱导培养基上，出愈率存在着较大差异，本发明的出愈率比现有技术的出愈率平均高出11.6％，从而使分化率也相应的提高了13％。
3、原因AgNO3的作用可以促进愈伤组织的器官发生与体细胞胚胎的发生，提高出愈率；促进一些再生困难种芽的产生；增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频率。
作用机制AgNO3能竞争性地作用于乙烯作用部位，从而抑制乙烯活性(乙烯合成量与芽分化能力呈负相关，乙烯不但抑制外植体芽分化，也抑制了再生苗的生长)，促进植物器官发生和体细胞胚胎发生。Ag+的存在使乙烯不能干扰多胺的合成，AgNO3通过促进多胺的合成提高体细胞胚胎和芽发生的频率。
权利要求
1.冰草成熟胚组织培养再生方法，其包括有如下步骤，(1)种子的选取及处理，(2)将成熟胚接种于愈伤诱导培养基上培养，(3)将愈伤诱导培养基培养的成熟胚转入继代培养基中培养；(4)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养；(5)待分化出小苗后转入生根培养基中生根；其特征在于a、所述种子的选取及处理选取有生活力的饱满种子，将种子在室温下用水浸泡后，剥去内外稃，放到含有1.0mg/L-4.0mg/L2，4-D的溶液中浸泡1.5小时-3.0小时，再消毒处理；b、所述愈伤诱导培养基MS基本培养基+0.1mol/L-0.5mol/L甘露醇+1mg/L-10mg/L2，4-D+浓度为0.2％-1.5％AgNO3+质量百分比为2％-10％的蔗糖+质量百分比0.55％-0.85％琼脂，其中所述愈伤诱导培养基的pH值5.8～6.0，常规方法高压灭菌，使出愈。
全文摘要
本发明公开了一种冰草成熟胚组织培养再生方法，在种子的选取及处理过程中；将剥去内外稃的饱满种子，放到含有1.0mg/L－4.0mg/L 2，4－D的溶液中浸泡1.5小时－3.0小时，再消毒处理；将成熟胚接种于愈伤诱导培养基上培养，其中愈伤诱导培养基增加了AgNO
文档编号A01C1/00GK1820583SQ20061000849
公开日2006年8月23日 申请日期2006年1月28日 优先权日2006年1月28日
发明者米福贵, 云锦凤, 霍秀文, 露晓平, 徐春波, 魏建华, 王宏枝, 李瑞芬, 张辉, 刘娟, 王桂花 申请人:内蒙古农业大学