专利名称：一种检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种甘蔗病原菌的检测方法，具体涉及一种检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的PCR方法，属于生物技术领域。
背景技术：
甘蔗锈病属于真菌性病害，包括褐锈病和黄锈病，其中褐锈病由黑顶柄锈菌 {Puccinia)引起,而黄锈病则由屈恩柄锈菌)引起。这两种病菌都主要经由风力传播，然后通过气孔侵入，从而造成感病品种蔗茎产量和蔗糖分的严重损失。褐锈病主要在夏季流行，而黄锈病则在春季更流行。
甘蔗褐锈病和黄锈病都主要发生在叶片上，初次侵染源都来自甘蔗本身或其他中间寄主，但受侵染后症状表现不同受褐锈病菌侵染后，初期甘蔗叶片上长出黄色小斑点， 色泽呈褐色至橙褐色，周围有黄色晕环，后期病斑因夏孢子堆呈脓疱状，最后病斑变黑色， 叶组织坏死，使甘蔗叶片失去光合能力，表现早衰；而受黄锈病菌侵染后，危害症状最初较轻，病斑不明显，仅在叶片上产生淡黄色小斑点，随病斑扩大，拉长的黄色病斑留下浅黄绿色晕圈，且颜色由桔色发展到橙棕色。但与一般的褐锈病不同，桔色锈斑从来不会发展为暗褐色。培育抗病品种，提高目标甘蔗品种的抗锈病性，并避免栽种感病品种，是控制甘蔗锈病(褐锈病和黄锈病)的最为经济有效的措施。在甘蔗抗锈病育种过程中，如何检测目标甘蔗品种中是否含有甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌以及检测的的效率和准确性直接影响甘蔗抗锈病育种的进程和效果。目前，一般采取两种方法判断种茎是否带菌一种是采用分离培养技术，在建立纯培养物的基础上，根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定。甘蔗褐锈病的病原为 黑顶柄锈菌，其夏孢子橙色或橙褐色，卵圆形至梨形，大小24.1 34.9X18.1 25.3 ( μ m)，具3 4个芽孔。夏孢子壁四周均匀加厚。冬孢子双细胞，壁光滑，顶壁常加厚，棍棒状，苍白至砖色，大小28. 9 45. 8 X 14. 5 21. 7 ( μ m),而甘蔗黄锈病的病原为屈恩柄锈菌，其夏孢堆叶背生，长O. 5 I _，表皮破裂时散出肉桂色粉状物。夏孢子卵圆形，表面具刺，浅黄色，大小25 42 X 17 25 ( μ m)，壁厚1. 5 2. 5 μ m，赤道上有4个芽孔。冬孢子堆黑色，冬孢子长椭圆形，顶端圆或平，深褐色，大小30 56X15 22 ( μ m)， 壁厚2 4. 5 μ m，具一隔膜，柄短，黄褐色；另一种是基于甘蔗褐锈病和黄锈病的表型症状不同，判断是否发生锈病以及所发生的锈病为褐锈病或者黄锈病，因此，可以采用种茎种植后，观察是否发生锈病以及所发生锈病的症状判断待检测甘蔗品种中是否含有褐锈病菌或黄锈病菌。但是，上述的第一种方法由于分离培养以及最终建立纯培养物需要时间长，加上分离过程杂菌污染等，都会影响分离效果，检出效率不高；第二种方法则受到甘蔗、环境条件和病原菌三个因素相互作用的影响，即便田间有病原、甘蔗基因型也是感病的，要发生病害，还需要合适的环境条件，这导致鉴定结果难以预料。同时，耗时长，工作量大，不同地点、 不同年份间的鉴定结果亦存在较大差异。显然，目前已有的技术方法，对于判断种茎是否带菌是不适用的，急需建立一种快速、准确，并能同时检测区分甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌的的 PCR检测方法。发明内容
本发明的目的是提供一种检测甘鹿褐锈病菌iPuccinia melanocephala )或黄锈病菌kiwhniim PCR方法，可用于田间甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌的早期诊断及检测。
本发明的一种检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的PCR方法，包括基因组DNA的提取、 PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于1、PCR检测体系的建立PCR扩增体系为总体积25μ 1，内含2. 5 μ I 10XPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 μ mol/L 的检测引物 PCR-F 和 PCR-R 各1. O μ 1，1. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因组 DNA，ddH20 补足到 25 μ I ;PCR扩增程序如下94 V 4 min ；94 V I min, 56 V 45 S，72 V I min，35 个循环； 72 0C 8 min ;所述 10XPCR 缓冲液组成成分为 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2 ;所述检测引物如下PCR-F :5，- GAGCATCAAGGAAAGTAGCAA -3/，PCR-R :5’- GAAGATGGTTCGAGCCACAATT -3’ ；2、PCR扩增产物的检测琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为585bp 的位置出现DNA条带,为甘鹿褐锈病菌存在的标志；在分子量为606 bp的位置出现DNA条带，为甘蔗黄锈病菌存在的标志。
本发明的应用效果本发明的一种检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的PCR方法，具有灵敏度高、效率高和所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有操作简便快速、准确性高和实用性好等优点。
1、操作简便快速应用本发明方法，提取待检测植株DNA、PCR扩增和常规琼脂糖凝胶电泳即可判定检测结果，无须对病原菌进行培养或田间种植鉴定，一般检测过程可在 5 6小时完成。
2、准确性高传统的甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌检测技术是根据病原物孢子的形态特征或者根据田间种植后病害表型症状鉴定来确定检疫对象，无法排除人为因素`的干扰， 很难区分形态相似种或容易受环境条件的影响，从而导致准确性不高；同时，形态学检测在近缘菌内的不同种之间可区别的特征较少，有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识和经验，方可作出准确的判断。而本发明根据甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌的特异性序列，选择甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌共同的一段保守序列设计特异引物，根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的检测和鉴定提供准确的靶标位点。经过与甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌以及其它不同植物中近缘病原菌的比较，该引物的准确率高。
3、高效、实用性好直接从待检测甘蔗品种中检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌具有重要的实际应用价值，两种病菌的同时检测则显得更为高效。目前，在甘蔗品种及其种质资源交换过程中，甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌的检测方法是根据病菌培养物所产生孢子的形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定，无法满足快速检疫的需要。为了使我们的检疫方法具有实际的应用价值，我们采用直接从待检测甘蔗品种中提取DNA后直接进行 PCR扩增，可在5 6小时内同时完成对甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌的检测。因此本方法大大提闻了检测的效率。
本发明为甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌的鉴定，提供了高灵敏度和高效率的快速检测体系，可用于田间甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌的早期诊断及检测，对抗褐锈病或抗黄锈病甘蔗育种和抗褐锈病或抗黄锈病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。
图1为使用甘蔗PCR-F和PCR-R检测引物鉴定5个待检测甘蔗品种中是否受甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌侵染(即是否含有甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌)的PCR扩增图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准；(代表以水作为模板的空白对照；PM代表对应甘蔗品种中含有甘蔗褐锈病菌；PK代表对应甘蔗品种中含有甘蔗黄锈病菌；Ν代表对应甘蔗品种中既不含有甘蔗褐锈病菌，也不含有甘蔗黄锈病菌；1-5代表5个甘蔗品种。图1中，甘蔗品种I和 2在分子量为585 bp的位置出现DNA条带，说明受甘蔗褐锈病菌侵染；甘蔗品种3和4在分子量为606 bp的位置出现DNA条带，说明受甘蔗黄锈病菌侵染；甘蔗品种5在分子量为 585 bp和606 bp的位置未出现DNA条带，说明未受甘蔗褐锈病菌或甘蔗黄锈病菌的侵染。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。
实施例1 一种检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的PCR方法一种检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的PCR方法，包括以下步骤1、基因组DNA的提取(1)取5g待检测甘蔗植株的叶片组织，置研钵，加入液氮磨碎成粉末，并在解冻前转入 50 ml的离心管中；(2)加入15ml,65 °C预热的SDS提取液，混匀后在65 1水浴保温40 min ；(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混匀后，冰浴 30 min ；(4)25000 g，4 °C离心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1预冷的异丙醇；(5)-20°C放置30 min后,钩出漂浮在液面的DNA,置于1. 5 ml离心管中，晾干后加入 750 μ I TE溶液；加等体积的平衡饱和酚，摇匀，12000 g，4 °C离心，10 min ；(6)转移上清至另一支1.5 ml离心管中，加等体积的氯仿，12000 g,4 °C ,离心10 min 后移出上层水相；(7)在水相中加2倍体积的无水乙醇，12000g，4 °C离心10 min，留沉淀，用体积浓度为70 %的乙醇清洗2次，并晾干；(8)加灭菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 1冰箱中保存备用。
2、PCR检测体系的建立PCR扩增体系为总体积25 μ 1，内含2. 5 μ I 10XPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 μ mol/L 的检测引物 PCR-F 和 PCR-R各1. 0 μ I,1. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng待检测甘蔗品种基因组DNA，ddH20 补足到25 μ I。
PCR扩增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 65 °C 45 s，72 °C I min，35个循环；72 0C 8 min ；所述检测引物PCR-F和PCR-R，是采用ITS-PCR技术，经过大量的筛选试验，获得了甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌共有的特异DNA片段，以此片段的DNA序列为基础，设计一对检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的检测引物。所述检测弓I物PCR-F和PCR-R具体如下PCR-F :5，- GAGCATCAAGGAAAGTAGCAA -3/，PCR-R :5’- GAAGATGGTTCGAGCCACAATT -3’。
3、PCR扩增产物的检测具体的检测方法为，取PCR扩增产物10 μ 1，加5 μ I上样缓冲液，混匀后点样于含有O.5 μ g/ml溴化乙锭的1. 5 % (m/V)琼脂糖凝胶上，于O. 5 X TBE缓冲液中，10 V/cm恒定电压下电泳1. 5 h，结束后在凝胶成像系统上成像并进行凝胶分析。
PCR产物的检测结果采用检测引物PCR-F和PCR-R对待检测甘蔗品种的基因组 DNA样品进行PCR扩增，结果如图1所示，受甘蔗褐锈病菌侵染(即含有甘蔗褐锈病節的甘蔗样品出现585 bp的DNA条带，受甘蔗黄锈病菌侵染(即含有甘蔗黄锈病菌)的甘蔗样品出现606 bp的DNA条带，而既没有受甘蔗褐锈病菌侵染也没有受甘蔗黄锈病菌侵染的甘蔗样品则不出现585 bp的DNA条带或者606 bp的DNA条带。
我们取5个待检测甘蔗品种用PCR检测和病原菌分离培养后的形态特征判别方法鉴定的结果进行比较，结果是一致的。如图1所示，出现分子量为585 bp的DNA条带的甘蔗品种，经病原菌培养后的孢子形态特征鉴定均含甘蔗褐锈病菌，出现分子量为606 bp的 DNA条带的甘蔗品种，经病原菌培养后的孢子形态特征鉴定均含甘蔗黄锈病菌；既未出现分子量为585 bp的DNA条带，也没有出现分子量为606 bp的DNA条带的甘蔗品种，经病原菌培养后的孢子形态特征鉴定结果显示均不含甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌。
本发明采用的主要试剂如下(所有化学试剂均为分析纯)1、SDS提取液NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41. 44 g、KH2 PO4 0. 24 g、SDS 2 g、甘油 50 ml,灭菌去离子I L, pH值7· 4 ;2、TE溶液10 mmol/L Tris-HCl, I mmol/L EDTA ；3、上样缓冲液0.1 %溴酚蓝，40 %蔗糖；4、0.5 X TBE 缓冲液44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3,1 mmol/L EDTA ；5、1.5 % (m/V)琼脂糖凝胶1. 5g 琼脂糖，100 ml ddH20 ；6、溴化乙锭试剂购自上海生工生物工程技术有限公司、PCR扩增试剂购自大连宝生物公司。
本发明所使用的仪器主要如下1、PCR扩增仪德国Eppendorf 5331 PCR扩增仪；2、电泳仪北京六一仪器 厂DYCZ-20ADNA序列分析电泳仪；3、离心机德国Eppendorf5810/5810R多功能台式离心机；4、凝胶成像系统美国BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像系统。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.一种检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的PCR方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于(1)PCR检测体系的建立PCR扩增体系为总体积25 μ 1，内含2. 5 μ I 10XPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 μ mol/L 的检测引物 PCR-F 和 PCR-R 各1. O μ 1，1. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因组 DNA，ddH20 补足到 25 μ I ;PCR 扩增程序如下94 V 4 min ；94 V I min，56 V 45 s，72 V I min，35 个循环； 72 °C 8 min ;所述 10XPCR 缓冲液组成成分为 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2 ;所述检测引物如下PCR-F :5，- GAGCATCAAGGAAAGTAGCAA -3/，PCR-R :5’- GAAGATGGTTCGAGCCACAATT -3’ ；(2)PCR扩增产物的检测琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为585bp 的位置出现DNA条带，为甘鹿褐锈病菌存在的标志；在分子量为606 bp的位置出现DNA条带，为甘蔗黄锈病菌存在的标志。
全文摘要
本发明涉及一种检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的PCR方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测。本发明的一种检测甘蔗褐锈病菌或黄锈病菌的PCR方法，具有灵敏度高、效率高和所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有操作简便快速、准确性高、高效和实用性好等优点。为甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌的鉴定，提供了高灵敏度和高效率的快速检测体系，可用于田间甘蔗褐锈病菌和黄锈病菌的早期诊断及检测，对抗褐锈病或抗黄锈病甘蔗育种和抗褐锈病或抗黄锈病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。
文档编号C12R1/645GK103060456SQ20131001570
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者阙友雄, 郭晋隆, 张玉叶, 许莉萍, 黄宁, 罗俊, 高世武, 陈如凯 申请人:福建农林大学