专利名称：一种检测甘蔗中寄生白条病菌的实时荧光定量pcr方法
技术领域：
本发明涉及甘蔗健康种苗与甘蔗抗性鉴定分子生物学技术领域，更具体地涉及一种检测甘蔗中寄生白条病菌拷贝数的实时荧光定量PCR方法。
背景技术：
甘蔗白条病(Leaf kald Disease，LSD)是由细菌白条黄单胞菌引起的世界性甘蔗病害之一，广泛分布于美国、加拿大等多个国家和地区，也是国内外重要检疫对象之一。 白条病菌为 Xanthomonas albilinearis Dowson，短小杆状，0. 6-1. 0X0. 3 μ m，由一单极鞭毛游行，呈革兰氏阴性反应，最适生长温度25-28°C，在培养基上凸起，闪光、透明，略红。该病症可分为两个时期(1)潜伏期病叶的白条常由叶片引申至叶鞘，直而狭，边界明显，宽约1-3毫米，至一线大小，正覆盖在维管束之上，后来整个叶片变淡青色。(2)严重期病叶开始凋萎，病株初现白色，继之枯萎、死亡，病茎节间短小，常产生侧芽茎。该病对甘蔗产量影响较大，一般新植产量损失10% 15%，宿根蔗产量损失更为严重，且影响宿根蔗年限，是甘蔗品种退化的重要原因之一，甘蔗LSD病原菌寄生于维管束中，至今尚无有效的化学防治方法。目前最有效的控制措施就是培育健康种苗，切断白条病菌依靠种苗传播途径。如何快速准确的鉴定甘蔗是否含有LSD病菌是甘蔗健康种苗生产的关键技术之一。现有检测白条病病菌的方法不能定量病原菌数量、准确性差、且费时、费力，因此，生产上迫切需要建立一种能高效、快速、准确、灵敏的检测白条病菌的方法。植物在长期的进化过程中经常会受到一些病原细菌的侵袭，一些非寄主或抗性植物在抵御病原菌侵害的过程中，是一种重要的抗病机制过敏性反应(hypersensitive reaction，HR)，发生不亲和反应导致病原菌侵入点周围植物细胞快速死亡而获得抗性；而感病植物则和侵染细菌发生亲和反应，最终病原细菌建立寄生并侵染致病。研究发现，植物病原细菌的一禾中 hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity gene)基因参与禾口介导HR的发生，并且能够决定病原菌的致病性。hrp基因可用于植物病原细菌的检测和鉴定，将其作为检测靶标是目前分子检测的新方向。传统的定性PCR检测技术一直面临着假阳性污染和不能准确定量两大问题，理论上讲，只要待测样品中有一个靶分子，PCR就能扩增出阳性，随即带来了假阳性偏高的问题，而且电泳所用染色剂EB (溴化乙锭)为强烈致癌物质，容易危害操作者的健康，且电泳花费较长时间。实时荧光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR)是在常规PCR基础上把荧光共振能量转移与荧光标记探针结合，巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术融合在一起的一项创造性技术，它具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、准确定量等特点。不仅有效地提高了检测速度和水平，而且检测的灵敏度也比一般的PCR检测方法高出 100倍左右，由于不再需要电泳、染色的步骤，大大简化实验操作步骤，缩短检测时间。本发明通过克隆白条病菌的致病基因之一 hrpB，经过NCBI网上序列比对，设计白条病菌的实时荧光定量PCR检测引物与探针，从而提供了一种用于检测甘蔗中寄生的白条病菌拷贝数的实时荧光定量PCR方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有检测白条病病菌不能定量病原菌数量、准确性差、 且费时、费力，而提供了一种检测甘蔗中寄生白条病菌的实时荧光定量PCR方法，省去了电泳检测时间，检测时间大大缩短，同时提高了检测结果的准确性。本发明的技术方案如下
本发明首先提供了一种利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗中寄生的白条病菌的引物及探针，所述的引物为以下序列的引物对正向引物5 ’ - CACGATGCTGTACACACTGC-3，和反向引物 5，-CTTGCAGGACCTTGCTTTG-3，探针FAM_5，- ACGTCCACGCCGTGAGTTGC-3，-TAMRA, 其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，TAMRA为标记在探针3’端的荧光淬灭基团。本发明还提供了一种检测甘蔗白条病菌的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤
(1)利用CTAB法提取白条病菌DNA；
(2)克隆HrpB基因片段，以白条病菌DNA为模板，采用上述引物对进行定性PCR扩增， 切胶纯化，连接到PMD18-T载体上，选择阳性克隆，提取质粒DNA，得到HrpB基因片段；测定质粒DNA的吸光值，并将吸光值转化成DNA浓度，再将DNA浓度转化成为拷贝数，进行梯度稀释，并以稀释后的DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线，并建立标准曲线方程；
(3)以待测样品蔗汁DNA为模板，用所述引物与探针进行实时荧光定量PCR扩增，通过将产生的的Ct值代入标准曲线方程转化成起始反应的DNA分子拷贝数，即一个分子拷贝数代表一个白条病菌。为了保证定量检测的准确性，因此在设计引物与探针时选择该病原菌所特异致病基因之一 HrpB基因，然后将该序列在NCBI进行序列比对，该基因为白条病菌所特异基因， 与其他生物基因没有显著的同源性。与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下
1、本发明首次根据白条病菌的致病基因HrpB设计特异性引物与探针；
2、本发明首次在白条病菌的检测上利用定量PCR法构建标准曲线方程，计算甘蔗样品中寄生的白条病菌数量，不仅特异性强，且灵敏度高；
3、本发明首次将白条病菌实时荧光定量PCR方法应用于甘蔗健康种苗检测、甘蔗抗性鉴定方面。
图1为白条病菌HrpB基因实时荧光定量PCR反应的扩增曲线，横坐标代表循环数 Ct值；纵坐标代表荧光信号强度；
图2为白条病菌扩增的标准曲线方程，横坐标代表白条病菌数量的对数值IoglO ；纵坐标代表甘蔗样品产生的循环数Ct值。
具体实施例方式
以下使用的各种生化试剂均来自生工生物工程(上海)有限公司，PCR相关试剂来自ABI公司，PMD18-T载体、引物与探针合成都来自TAKARA宝生物工程(大连)有限公司， 测序完成于南京金斯瑞生物有限公司。实施例1
采用CTAB法提取甘蔗蔗汁中寄生的白条病菌Xanthomonas albilineans(现保存于福建农林大学甘蔗综合研究所，该菌的分离培养，参考Davis Μ. J, Rott PP, Dean J. L. et al. Selective isolation of Xanthomonas albilineans, causal agent of leaf scald disease, Plant diseasesl995; 476-483)的核酸DNA，以该模板利用上述引物对进行定性PCR扩增，采用Eppendorf Mastercycler EP PCR热循环仪5333型基因扩增仪。25 μ L PCR 反应体系组成IOXPCRBufTer(Mg2+) 2.5 μ L，dNTP (2. 5 mmol/L) 2 yL，正反向引物(10 ymol/L)各 1 μ L，ExTaq 酶(5U/y L) 0. 125 yL，模板 DNA (50 ng/μ L) 1 yL，力口灭菌双蒸水使总体积为17. 375。PCR扩增条件95 "C 5 min ；95 "C 30 S, 58 "C 30 S, 72 0C 20 S，35个循环；最后72 °C延伸7 min后4 °C保存备用。反应结束后将所得PCR 产物用于1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析，并进行胶回收纯化，连接到PMD18-T载体上，选择阳性克隆，提取质粒DNA，送测序公司进行测序，测序完成后将所得到测序结果Blast比对，结果正常后，继续将质粒DNA采用紫外分光光度计在沈0 nm测定吸光度值。然后根据公式(DNA 样品浓度(ug/ml)=0D26CIX50X稀释倍数)将吸光度值转换成质粒DNA浓度。在根据以下公式将质粒DNA浓度转化为拷贝数。MW =碱基数 χ 660 dalton/bp
(6. 02 χ 10 23 χ (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml
对于双链 DNA, 256 ng/μ L 质粒 DNA 的 2798 bp 长度相当于 8. 4 χ10 13 copies/μ L 纯化后的质粒DNA定量后，将该质粒DNA作为标准品，采用倍比梯度稀释法进行稀释， 即Iv原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii ；Iv标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii，以此类推进行梯度稀释，使得质粒的拷贝数为108-10，分成8个标准样品处理，以此稀释后质粒DNA为模板，每个标准样品处理重复3次。分别以大肠杆菌、宿根矮化病菌、 Leifsonia ginsengi和Leifsonia 菌DNA和健康种苗的蔗汁DNA为阴性对照，以DNA 为白条病菌阳性对照，以双蒸水为空白对照。采用ABI公司实时荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，反应体系包括TaqMan Universal Master Mix (2 Χ) 12. 5 yL;正、反向引物(10 μ mol/L)各 0. 4 μ L ； TaqMan 探针(10 μ mol/L) 0.2 “1^;0嫩模板(1 μ g/μ L)l. 0 μ L ；补水至 25 μ L，反应条件50 "C, 2 min，预变性 95 "C, 10 min ；95 "C, 15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40 个循环，在 60°C 进行单点荧光检测。利用ABI公司7500定量PCR仪进行实时荧光定量PCR扩增，制作标准曲线(如图1)，进而构建标准曲线方程(如图2)。反应结束后，利用软件将反应中的数据分析生成标准曲线，R2表示标准曲线相关系数，Slope表示标准曲线斜率，Efficiency表示反应的扩增效率，Y-interc印t表示Y轴的截距。正常的标准曲线应满足以下条件R2 > 0.99，-3.5 < Slope < -3.0，0. 9 < Efficiency < 1.2。本实施例构建的标准曲线方程为:Y=-3. 3918Χ+36. 476。实施例2
将2011年福建农林大学校内的甘蔗资源圃甘蔗分别提取蔗汁DNA，5个不同品种甘蔗有以下Badila, CP29-126、Cc^81、CP92-1167、Q174，采用打气泵吹汁法和高速离心法提取甘蔗汁液，按照传统的核酸提取方法CTAB法，以纯化后的基因组DNA作为模板，利用ABI 公司7500实时荧光定量PCR仪，采用本发明特异性的引物与TaqMan探针进行实时荧光定量 PCR 扩增。反应体系包括TaqMan Universal Master Mix (2Χ) 12.5 μ L ；，正、反向上下游引物(10 μπιοΙ/L)各 0.4 μ L ;TaqMan 探针(10 μ mol/L) 0.2 yL;DNA 模板 1.0 μ L ；补水至25 μ L，每个样品做3次重复。反应条件50 °C，2 min，预变性95 °C，10 min ； 95 15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40个循环，在60°C进行单点荧光检测。然后导入已建立的标准曲线方程利用荧光定量PCR仪软件计算生成的Ct值，将Ct值导入标准曲线方程计算检测起始核酸分子的拷贝数。经过计算白条病菌在5个不同甘蔗品种中的数量分别为Badila为1.2X103、 Co281为2.9\103、0 29-126为5.6\104’，其余2个品种未检测出白条病菌。申请人:采用本方法检测过多种其他病菌(包括大肠杆菌、宿根矮化病菌、 Leifsonia ginseng!和Leifsonia 菌DNA、以健康种苗的蔗汁DNA为阴性对照，以白条病菌DNA为阳性对照，以双蒸水为空白对照)，分别进行上述引物与探针的特异性检测，结果发现该反应特异性强，其他待测菌株没有扩增曲线产生。本发明的检测限为10个拷贝，检测在IO8-IO个拷贝数之间。
权利要求
1.一种利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗中寄生白条病菌的引物及探针，其特征在于所述的引物为以下序列的引物对正向引物序列5’ -GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列 5’ -CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3，，探针序列是 FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-T AMRA。
2.一种根据权利要求1所述的引物及探针检测甘蔗中寄生白条病菌的实时荧光定量 PCR方法，其特征在于包括以下步骤(1)利用CTAB法提取白条病菌DNA；(2)克隆HrpB基因片段，以白条病菌DNA为模板，采用上述引物对进行定性PCR扩增， 切胶纯化，连接到PMD18-T载体上，选择阳性克隆，提取质粒DNA，得到HrpB基因片段；测定质粒DNA的吸光值，并将吸光值转化成DNA浓度，再将DNA浓度转化成为拷贝数，进行梯度稀释，并以稀释后的DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线，并建立标准曲线方程；(3)以待测样品蔗汁DNA为模板，用所述引物与探针进行实时荧光定量PCR扩增，通过将产生的的Ct值代入标准曲线方程转化成起始反应的DNA分子拷贝数，即一个分子拷贝数代表一个白条病菌。
3.根据权利要求2所述检测甘蔗中寄生白条病菌的实时荧光定量PCR方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为25 μ L 2 X TaqMan Universal Master Mix 12.5 μ L ；10 ymol/L正向引物与反向引物各0. 4 μ L ；10 μ mol/L探针0. 2 μ L ;DNA模板1. 0 μ L ；补水至25 μ L。
4.根据权利要求2所述检测甘蔗中寄生白条病菌的实时荧光定量PCR方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR扩增的反应条件为50 2 min，预变性95 10 min ；95 °C， 15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40个循环，在60°C进行单点荧光检测。
全文摘要
本发明涉及一种检测甘蔗中寄生白条病菌拷贝数的实时荧光定量PCR方法。首先提供了一种利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗中寄生白条病菌的引物及探针，所述的引物为以下序列的引物对正向引物序列5’-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列5’-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3’，探针序列是FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-TAMRA，然后采集和处理甘蔗蔗汁并提取总DNA，利用实时荧光定量PCR方法检测甘蔗中感染的白条病菌HrpB基因，通过扩增过程生成的Ct值，代入标准曲线方程，转换成起始反应的DNA分子拷贝数，从而达到定量检测甘蔗中感染白条病菌数量的目的。
文档编号C12R1/64GK102312015SQ20111031655
公开日2012年1月11日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者王恒波, 许莉萍, 郭晋隆, 陈如凯, 陈平华, 高三基 申请人:福建农林大学