一种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法，包括以下步骤：制备磁性Fe3O4磁粒子，并用油酸对其进行改性，标记为油酸-Fe3O4；以苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体、二乙烯基苯为交联剂、Span-80为表面活性剂、油酸-Fe3O4为磁粒子，采用表面活性剂反胶团乳化聚合法制备，制备聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球。本发明步骤简单，实验条件温和，所制备出磁性多孔微球粒径分布均匀，表面含有多种可共价结合微生物的官能基团，具有超顺磁性，可在外加磁性的条件下实现回收和再利用。
【专利说明】—种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及一种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法。
【【背景技术】】
[0002]氮氧化物(NOx)是酸雨、光化学烟雾等空气污染的主要原因之一。烟气中95%以上的NOx为难溶于水的NO，脱除难度高。Fe11 (EDTA)可与NO络合形成Fe11 (EDTA) -NO,快速脱除NOx，脱除效率高，同时Fe11(EDTA)易被烟气中的O2(体积含量3~8%)氧化成Fem(EDTA)，难以再生和循环利用。部分微生物可还原Fe11 (EDTA) -NO和Fe111 (EDTA)，能很好地解决吸收剂的再生问题，由此生物还原耦合络合吸收脱除烟气中NOx的工艺应运而生。但如何提高工艺中优势菌种的数量，维持优势菌种的性能，减少Fe11 (EDTA) -NO对Fe111 (EDTA)还原的抑制，是实现络合吸收剂完全再生，使系统达到高效、稳定的关键所在。为此，专利发明人提出了采用固定化微生物两级还原耦合化学吸收净化NOx的新工艺。
[0003]磁性聚合微球利用多种有机高分子聚合物复合而成，可有效调节微球结构并对其改性。磁性聚合微球不仅具有良好的生物相容性，且在外加磁场条件下可实现有效分离和回收。由于微球的粒径小，比表面积大，吸附能力强，已应用于靶向药物、固定化酶和细胞、固定化活性污泥、吸附去除重金属离子和基因研究等方面，涉及生物医学、环境工程、生物工程等诸多领域。
[0004]制备性能优良的磁性聚合微球载体是固定化微生物两级还原耦合化学吸收净化NOx新工艺高效稳定运行的重要保证条件之一。
【
【发明内容】
】
[0005]本发明要解决的技术问题，在于提供一种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法，该方法步骤简单，实验条件温和，所制备出磁性多孔微球粒径分布均匀，表面含有多种可共价结合微生物的官能基团，具有超顺磁性，可在外加磁性的条件下实现回收和再利用。
[0006]本发明是这样实现的:
[0007]—种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法，包括以下步骤:
[0008]步骤10、制备磁性Fe3O4磁粒子，并用油酸对其进行改性，标记为油酸-Fe3O4 ；
[0009]步骤20、以苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体、二乙烯基苯为交联剂、Span-80为表面活性剂、油酸-Fe3O4为磁粒子,采用表面活性剂反胶团乳化聚合法制备,制备聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球。
[0010]进一步地，所述步骤10的具体步骤如下:
[0011]充N2保护下，摩尔比为`2:1的FeCl3 *6H20,FeCl2.4Η20混合物溶解于去离子水中，反应半小时后，在80°C以上的水浴条件下快速加入NH3.H20，2min后缓慢滴加油酸;反应4小时后冷却至室温，用磁铁将所得产物与溶液分离，并用去离子水洗涤产物至中性；最后于室温条件下真空干燥，得到油酸改性Fe3O4，标记为油酸_Fe304。[0012]进一步地，所述步骤20的具体步骤如下:
[0013]用超纯水配制质量浓度为2%的聚乙烯醇溶液，在80°C以上的水浴条件下使其充分溶解，然后调节水浴温度为48~53°C，依次加入Na2S04、十二烷基硫酸钠、对苯二酹，即为水相；
[0014]取适量甲基丙烯酸缩水甘油酯、苯乙烯、二乙烯基苯、过氧化苯甲酰、十六烷、油酸_Fe304、Span-80，超声分散至均匀，即为油相；
[0015]将油相逐滴加入水相中，在75~85°C条件下反应20~25小时，得到溶胶状磁性物质，冷却至室温，得磁性聚合微球；最后把所得磁性聚合微球用磁铁分离后，分别用蒸馏水和乙醇清洗，室温下真空干燥，所得产物为聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球。
[0016]进一步地，所述聚乙烯醇为PVA-124。
[0017]进一步地,聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球内嵌入了 Fe3O4的晶体结构。
[0018]进一步地，聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的油酸-Fe3O4质量分数为20%~23%。。
[0019]进一步地，聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的磁饱和强度为1.8~2.0emu/g。
[0020]进一步地,聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的粒径在30~ΙΙΟμπι之间。
[0021]本发明具有如下优点:
[0022]本发明方法步骤简单，实验条件温和，采用改良的表面活性剂反胶团乳化聚合法制备出聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球，并利用油酸作为改性剂有效地改善了磁粒子Fe3O4的分散性和表面活性，能够保证磁性Fe3`O4可以均匀的分散到油性有机反应物中并参与聚合反应。
[0023]本发明所制备出的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球粒径分布均匀，表面含有多种可共价结合微生物的官能基团，具有超顺磁性，可在外加磁性的条件下实现回收和再利用。微生物经过磁性聚合微球固定化后，不仅提高了对Fe111 (EDTA)的还原活性，而且增强了抵抗外界不利环境的能力。同时，可以有效的与铁还原菌共价结合，不仅为微生物提供了附着场所，减小外界不利条件对其的毒害作用，又可提高优势菌种的密度。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0024]下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0025]图1为本发明的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的SEM图。
[0026]图2为本发明的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的红外波谱图。
[0027]图3为本发明的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的XRD图。
[0028]图4为本发明的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的热重图。
[0029]图5为本发明的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的磁滞回线图。
[0030]图6为本发明的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球固定化铁还原菌的SEM图。
【【具体实施方式】】
[0031]请参阅图1~6所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
[0032]本发明涉及一种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法，包括以下步骤:
[0033]步骤10、制备磁性Fe3O4磁粒子，并用油酸对其进行改性，标记为油酸-Fe3O4 ；[0034]步骤20、以苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体、二乙烯基苯为交联剂、Span-80为表面活性剂、油酸-Fe3O4为磁粒子,采用表面活性剂反胶团乳化聚合法制备,制备聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球。
[0035]所述步骤10的具体步骤如下:
[0036]充N2保护下，摩尔比为2:1的FeCl3.6H20、FeCl2.4H20混合物溶解于去离子水中，反应半小时后,在80°C以上的水浴条件下快速加入适量NH3 -H2O,约2min后缓慢滴加适量油酸；反应数小时后冷却至室温，用磁铁将所得产物与溶液分离，并用去离子水洗涤产物至中性；最后于室温条件下真空干燥，得到油酸改性Fe3O4，标记为油酸-Fe304。
[0037]所述步骤20的具体步骤如下:
[0038]用超纯水配制质量浓度为2%的聚乙烯醇溶液，在80°C以上的水浴条件下使其充分溶解，然后调节水浴温度为48~53°C，依次加入Na2SO4、十二烷基硫酸钠、对苯二酹，即为水相；
[0039]取适量甲基丙烯酸缩水甘油酯、苯乙烯、二乙烯基苯、过氧化苯甲酰、十六烷、油酸_Fe304、Span-80，超声分散至均匀，即为油相；
[0040]将油相逐滴加入水相中，在75~85°C条件下反应20~25小时，得到溶胶状磁性物质，冷却至室温，得磁性聚合微球；最后把所得磁性聚合微球用磁铁分离后，分别用蒸馏水和乙醇清洗，室温下真空干燥，所得产物为聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球。
[0041]各原料投加质量比例如下:
[0042]聚乙烯醇=Na2SO4:SDS:`HQ:GMA:St:DVB:BP0:HD:油酸-Fe3O4:Span-80 约为 200:10:1.5:1:200:100:200:20:30:10:200。
[0043]所述聚乙烯醇为PVA-124 ;聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球内嵌入了 Fe3O4的晶体结构；聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的油酸-Fe3O4质量分数20~23% ;聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的磁饱和强度为1.8~2.0emu/g ;聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的粒径在30~110 μ m之间。
[0044]本发明提供的方法所制备的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球材料，如图1所示，呈均匀的球形，表面布满了孔道。其粒径分布在30~IlOym之间。
[0045]聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球表面含有-CH2的对称和不对称的延伸振动峰，-C=C, -C-O的伸缩振动峰，以及-COOH的伸缩振动峰，如图2所示。
[0046]聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球内嵌入了 Fe3O4的晶体结构，如图3所示。
[0047]聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的油酸-Fe3O4质量分数20~23%，如图4所示。
[0048]聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的具有超顺磁性,磁饱和强度为1.8~2.0emu/g,如图5所示。
[0049]本发明所制备的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球表面可以共价结合铁还原菌，如图6所不，图中圆圈圈出的部分为一结合的铁还原菌。
[0050]以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0051]1.铁还原菌富集和驯化
[0052](I)富集:本实验所用的菌株分离、纯化自福建某污水处理厂的活性污泥。克雷伯氏菌属，其基因库号码为⑶167258。用LB培养基富集培养。
[0053]LB培养基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，NaC110。[0054](2)驯化:取上述菌液IOmL接种于已经高温灭菌的Fe111 (EDTA) (2mmol/L)选择培养基中(400mL)。调节pH值至6.5~7.0,放入恒温摇床中培养，每天更换一次培养液，接种IOmL到400mL新鲜培养液中进行驯化，以2mmol/L为梯度，逐步增加Fem(EDTA)在培养液中的浓度，使其最终达20mmol/L，驯化30天。
[0055]基础培养基(mg/L)=K2HPO4.3H201000, KH2P04625, Na2S0370, MgSO4IOO, CaCl22,MnSO40.5, Na2MoO40.1, CuSO4.5H200.1。
[0056]Fe111 (EDTA)选择培养基的制备:葡萄糖 lmg/L，NH4Cl lmg/L, K2HPO4.3H201000mg/L, KH2P04625mg/L, Fe111 (EDTA) 10mmol/L，基础培养基 100mL。
[0057]2、聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的制备
[0058](I)充N2保护下，把FeCl3.6H20和FeCl2.4H20摩尔比为2:1的混合物质溶解于去离子水中，水浴加热至90~100°C反应30min ;然后迅速加入60~80mLNH3.Η20，2π?η后缓慢滴加油酸；反应4h后冷却至室温，用磁铁将所得产物吸出并与溶液分离，再用蒸馏水将产物洗涤至中性；最后，室温条件下真空干燥，得到油酸改性Fe3O4，标记为油酸-Fe304。
[0059](2)首先，配制由聚乙烯醇(3g)、Na2SO4 (0.lg)、十二烷基硫酸钠(0.015g)和对苯二酚(0.01)组成的水相，溶解于去离子水中，搅拌均匀；在N2保护环境下，将以苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯组成的单体(质量比为1:2)、二乙烯基苯(2g)、十六烷(0.2g)、Span-80 (占单体质量50%)、过氧化苯甲酰(0.16g)和油酸-Fe3O4 (0.15~2.0g)配制成的油相经过超声分散均匀后加入到水相中，调节转速至300~400r/min，温度为75~85°C，聚合反应20h ;最后把所得磁性聚合微球用磁铁分离后，分别用蒸馏水和乙醇清洗，温室下真空干燥，所得产物为聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球。
[0060]3、磁性生物微球的制备
[0061]称取5.0mg/mL聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球,置于IOOmL血清瓶中，加入60mL已灭菌的Fe111 (EDTA) (10mmol/L)选择性基础培养基，以N2驱氧并密封，在140°C高温条件下灭菌20min后,接种0.14mg/mLFD_3。随后置于40°C , 140r/min的恒温摇床中振荡培养24h，用磁铁将磁性生物微球与培养基分离开来，弃去上层清液，磷酸缓冲液清洗数次，得到磁性生物微球。
[0062]实施例1
[0063]将磁性生物微球接种到60mL已灭菌的Fe111 (EDTA) (IOmmoI/L)选择性培养基，在400C，140r/min的恒温摇床中振荡培养24h后，培养基中Fe111 (EDTA)的浓度为0.5mmol/L。相同培养条件下只添加游离菌的对照组，培养基中Fem(EDTA)的浓度为lmmol/L。
[0064]实施例2
[0065]将磁性生物微球接种到60mL已灭菌的Fe111 (EDTA) (IOmmoI/L)选择性培养基，在45°C,140r/min的恒温摇床中振荡培养24h后，培养基中Fem(EDTA)的浓度为2.29mmol/L0相同培养条件下只添加游离菌的对照组，培养基中Fem(EDTA)的浓度为2.05mmol/L。
[0066]实施例3
[0067]将磁性生物微球接种到60mL已灭菌的Fe111 (EDTA) (IOmmoI/L)选择性培养基，在50°C,140r/min的恒温摇床中振荡培养24h后，培养基中Fem(EDTA)的浓度为4.13mmol/L0相同培养条件下只添加游离菌的对照组，培养基中Fem(EDTA)的浓度为5.18mmol/L。
[0068]实施例4[0069]将磁性生物微球接种到60mL已灭菌的Fe111 (EDTA) (IOmmoI/L)选择性培养基，在60°C,140r/min的恒温摇床中振荡培养24h后，培养基中Fem(EDTA)的浓度为5.18mmol/L0相同培养条件下只添加游离菌的对照组，培养基中Fem(EDTA)的浓度为5.64mmol/L。
[0070]以上实例说明铁还原菌经过聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球固定化后，对Fe111(EDTA)的还原较相同培养条件下的游离铁还原菌有所提高，这是因为菌种经过磁性聚合微球固定化后不仅提高了优势菌种的密度，而且提高了菌种对外界不利环境的抵抗作用。40°C时固定化铁还原菌对Fe111 (EDTA)的还原效率最高，因此最佳的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球固定化铁还原菌的温度为40°C。
[0071]本发明方法步骤简单，实验条件温和，采用改良的表面活性剂反胶团乳化聚合法制备出聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球，并利用油酸作为改性剂有效地改善了磁粒子Fe3O4的分散性和表面活性，能够保证磁性Fe3O4可以均匀的分散到油性有机反应物中并参与聚合反应。
[0072]本发明所制备出的聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球粒径分布均匀，表面含有多种可共价结合微生物的官能基团，具有超顺磁性，可在外加磁性的条件下实现回收和再利用。微生物经过磁性聚合微球固定化后，不仅提高了对Fe111 (EDTA)的还原活性，而且增强了抵抗外界不利环境的能力。同时，可以有效的与铁还原菌共价结合，不仅为微生物提供了附着场所，减小外界不利条件对其的毒害作用，又可提高优势菌种的密度。
[0073]虽然以上描述了本发明的【具体实施方式】，但是熟悉本【技术领域】的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。`
【权利要求】
1.一种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤10、制备磁性Fe3O4磁粒子，并用油酸对其进行改性，标记为油酸-Fe3O4 ； 步骤20、以苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体、二乙烯基苯为交联剂、Span-80为表面活性剂、油酸-Fe3O4为磁粒子，采用表面活性剂反胶团乳化聚合法制备，制备聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球。
2.根据权利要求1所述的一种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法，其特征在于:所述步骤10的具体步骤如下: 充N2保护下，摩尔比为2:1的FeCl3.6H20、FeCl2.4H20混合物溶解于去离子水中，反应半小时后，在80°C以上的水浴条件下快速加入NH3 *H20,2min后缓慢滴加油酸；反应4小时后冷却至室温，用磁铁将所得产物与溶液分离，并用去离子水洗涤产物至中性；最后于室温条件下真空干燥，得到油酸改性Fe3O4,标记为油酸_Fe304。
3.根据权利要求1或2所述的一种可用于固定化铁还原菌的磁性聚合微球的制备方法，其特征在于:所述步 骤20的具体步骤如下: 用超纯水配制质量浓度为2%的聚乙烯醇溶液，在80°C以上的水浴条件下使其充分溶解，然后调节水浴温度为48°C~53°C，依次加入Na2S04、十二烷基硫酸钠、对苯二酹，即为水相； 取甲基丙烯酸缩水甘油酯、苯乙烯、二乙烯基苯、过氧化苯甲酰、十六烷、油酸-Fe304、Span-80,超声分散至均匀，即为油相； 将油相逐滴加入水相中，在75~85°C条件下反应20~25小时，得到溶胶状磁性物质，冷却至室温，得磁性聚合微球；最后把所得磁性聚合微球用磁铁分离后，分别用蒸馏水和乙醇清洗，室温下真空干燥，所得产物为聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:所述聚乙烯醇为PVA-124。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于--聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球内嵌入了 Fe3O4的晶体结构。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于--聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的油酸-Fe3O4量分数20~23%。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于--聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的磁饱和强度为1.8~2.0emu/g。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于--聚(苯乙烯-GMA)磁性多孔微球的粒径在30~110 μ m之间。
【文档编号】C12N11/08GK103554389SQ201310460267
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】荆国华, 周作明, 王晓艳 申请人:华侨大学