本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及用于诊断不稳定心绞痛的试剂盒及试剂在制备试剂盒中的用途。
背景技术：
：在老年性疾病中，以冠心病为首的心血管疾病是导致老年人死亡的首要原因。大量的统计数据和临床研究表明急性冠脉综合征在老年人群中仍是导致冠心病致残、致死的“罪魁祸首”和造成沉重疾病负担的主要原因。急性冠脉综合征是冠心病最主要的临床类型，包括st段抬高型心肌梗死、非st段抬高型心肌梗死和不稳定性心绞痛。心肌梗死可通过肌钙蛋白i或t的升高早期识别，而不稳定性心绞痛则缺乏早期的预警标志物。老年人的急性冠脉综合征往往发病突然、进展迅速以及死亡率高，且临床症状具有隐匿和不典型的特征。目前临床上迫切需要早期检出和准确识别老年人急性冠脉综合征，尤其是不稳定性心绞痛的手段，这对有效预警老年患者急性冠脉综合征发生、减少不良心血管事件具有十分重要的临床和公共卫生意义。因此，急性冠脉综合征，尤其是不稳定性心绞痛的早期诊断，仍然需要科学家的不断探索和研究。技术实现要素：本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：micrornas是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链rna，在基因表达调控中发挥至关重要的作用，可诱导靶mrna的降解和/或抑制其翻译成蛋白，从而在转录后水平下调靶基因的表达。据保守估计，micrornas调控大约60％的人类蛋白编码基因。越来越多的研究显示循环micrornas可以作为一种理想的心血管疾病新型生物标志物，主要原因为：1.参与易损斑块形成的多个环节；2.具有疾病特定表达模式；3.循环中可被检出且稳定性好。发明人通过筛选老年不稳定心绞痛患者与稳定性心绞痛对照者差异表达的循环micrornas，惊喜地发现，mir-1207-5p、mir-1225-5p、mir-3162-3p在不稳定心绞痛患者与稳定性心绞痛对照者之间具有显著的差异表达，mir-1207-5p、mir-1225-5p、mir-3162-3p可作为临床诊断不稳定心绞痛的可靠指标。为此，在本发明的第一方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断不稳定心绞痛，所述试剂用于检测mir-3162-3p。发明人通过实验惊喜地发现，mir-3162-3p在不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者之间具有显著的表达差异，其在老年不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者中有较好的诊断价值(auc＝0.790，p＝0.003)。其敏感性为76.7％，特异性为70％。用于检测mir-3162-3p的试剂制备的试剂盒可有效用于诊断不稳定心绞痛，具有敏感性高、特异性强的特点。根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述试剂盒用于区分不稳定心绞痛和稳定性心绞痛。用于检测mir-3162-3p的试剂制备的试剂盒可更加有效地用于区分不稳定心绞痛和稳定性心绞痛，具有敏感性更高、特异性更强的特点。根据本发明的实施例，所述试剂进一步用于检测mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一。发明人发现，mir-1207-5p/mir-3162-3p在老年不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者中有较mir-3162-3p单独诊断更好的诊断价值(auc＝0.817，p<0.01),其敏感性为76.7％，特异性为70％；mir-1225-5p/mir-3162-3p在老年不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者中有较mir-3162-3p单独诊断更好的诊断价值(auc＝0.833，p<0.01),其敏感性为90％，特异性为66.7％；mir-1207-5p、mir-1225-5p和mir-3162-3p三种联合诊断较mir-3162-3p单独诊断和mir-1207-5p/mir-3162-3p以及mir-1225-5p/mir-3162-3p联合诊断具有更高的诊断价值(auc＝0.841，p<0.001)，其敏感性为86.7％，特异性为70％。根据本发明的实施例，所述试剂为用于识别mir-3162-3p的探针、抗体、活性因子或用于扩增mir-3162-3p的引物。用于识别mir-3162-3p的探针、抗体或活性因子能够特异性识别mir-3162-3p，用于扩增mir-3162-3p的引物能够特异性扩增mir-3162-3p，从而通过pcr检测mir-3162-3p的表达量。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno：1～2所示的核苷酸序列，所述引物具有seqidno：3或4所示的核苷酸序列。具有seqidno：1或2所示的核苷酸序列的探针可通过碱基互补配对与mir-3162-3p特异性结合，具有seqidno：3或4所示的核苷酸序列的引物能够特异性扩增mir-3162-3p，获得的扩增条带清晰，杂带少。gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactgggga(seqidno：1)。tggggagtggaggggtaggga(seqidno：2)。agcgtccctacccctccac(seqidno：3)。atccagtgcagggtccgagg(seqidno：4)。根据本发明的实施例，所述试剂为识别mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的探针、抗体或活性因子或用于扩增mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的引物。用于识别mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的探针、抗体或活性因子能够特异性识别mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一，用于扩增mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的引物能够特异性扩增mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一，从而通过pcr检测mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的表达量。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno：5～8所示的核苷酸序列，所述引物具有seqidno：9～12任一项所示的核苷酸序列。具有seqidno：5～8所示的核苷酸序列的探针可通过碱基互补配对与mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一特异性结合，具有seqidno：9～12任一项所示的核苷酸序列的引物能够特异性扩增mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一，获得的扩增条带清晰，杂带少。gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccccccc(seqidno：5)。cccctcccagcctccctacca(seqidno：6)。gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccccctc(seqidno：7)。ccccccactgggccgtacccac(seqidno：8)。acggtgggtacggcccagt(seqidno：9)。atccagtgcagggtccgagg(seqidno：10)。gcgtggcagggaggctgg(seqidno：11)。atccagtgcagggtccgagg(seqidno：12)。其中，seqidno：5～6所示的核苷酸序列是特异性识别mir-1207-5p的探针所具有的核苷酸序列，seqidno：7～8所示的核苷酸序列是特异性识别mir-1225-5p的探针所具有的核苷酸序列。seqidno：9～10所示的核苷酸序列是特异性扩增mir-1207-5p的引物所具有的核苷酸序列。seqidno：11～12所示的核苷酸序列是特异性扩增mir-1225-5p的引物所具有的的核苷酸序列。在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于诊断不稳定心绞痛的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第一试剂，所述第一试剂用于检测mir-3162-3p。发明人通过实验惊喜地发现，mir-3162-3p在不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者之间具有显著的表达差异，其在老年不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者中有较好的诊断价值(auc＝0.790，p＝0.003)。其敏感性为76.7％，特异性为70％。包括用于检测mir-3162-3p的第一试剂的试剂盒可有效用于诊断不稳定心绞痛，具有敏感性高、特异性强的特点。根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述试剂盒用于区分不稳定心绞痛和稳定性心绞痛。利用根据本发明实施例的试剂盒区分不稳定心绞痛和稳定性心绞痛，具有敏感性更高、特异性更强的特点。根据本发明的实施例，所述第一试剂为识别mir-3162-3p的探针、抗体、活性因子或用于扩增mir-3162-3p的引物。用于识别mir-3162-3p的探针、抗体或活性因子能够特异性识别mir-3162-3p，用于扩增mir-3162-3p的引物能够特异性扩增mir-3162-3p，从而利用第一试剂通过pcr检测mir-3162-3p的表达量。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno：1所示的核苷酸序列，所述引物具有seqidno：2或3所示的核苷酸序列。具有seqidno：1所示的核苷酸序列的探针可通过碱基互补配对与mir-3162-3p特异性结合，具有seqidno：2或3所示的核苷酸序列的引物能够特异性扩增mir-3162-3p，获得的扩增条带清晰，杂带少。根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括第二试剂，所述第二试剂用于检测mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一。发明人发现，mir-1207-5p/mir-3162-3p在老年不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者中有较mir-3162-3p单独诊断更好的诊断价值(auc＝0.817，p<0.01),其敏感性为76.7％，特异性为70％；mir-1225-5p/mir-3162-3p在老年不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者中有较mir-3162-3p单独诊断更好的诊断价值(auc＝0.833，p<0.01),其敏感性为90％，特异性为66.7％；mir-1207-5p、mir-1225-5p和mir-3162-3p三种联合诊断较mir-3162-3p单独诊断和mir-1207-5p/mir-3162-3p以及mir-1225-5p/mir-3162-3p联合诊断具有更高的诊断价值(auc＝0.841，p<0.001)，其敏感性为86.7％，特异性为70％。进一步包括用于检测mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的第二试剂的试剂盒可更加有效用于诊断不稳定心绞痛，具有更高敏感性、特异性更强的特点。根据本发明的实施例，所述第二试剂为识别mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的探针、抗体或活性因子或用于扩增mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的引物。用于识别mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的探针、抗体或活性因子能够特异性识别mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一，用于扩增mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的引物能够特异性扩增mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一，从而通过pcr检测mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一的表达量。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno：4或5所示的核苷酸序列，所述引物具有seqidno：6～9任一项所示的核苷酸序列。具有seqidno：4或5所示的核苷酸序列的探针可通过碱基互补配对与mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一特异性结合，具有seqidno：6～9任一项所示的核苷酸序列的引物能够特异性扩增mir-1225-5p和mir-1207-5p的至少之一，获得的扩增条带清晰，杂带少。附图说明图1是根据本发明实施例的芯片检测的两组血浆样本的pca分析；图2是根据本发明实施例的不稳定心绞痛和稳定性心绞痛两组患者血浆mirna的表达热图；图3是根据本发明实施例的筛选出的mirnapcr验证结果；图4是根据本发明实施例的mir-3162-3p的受试者工作特征曲线；图5是根据本发明实施例的mir-1202/mir-3162-3p的受试者工作特征曲线；图6是根据本发明实施例的mir-1207-5p/mir-3162-3p的受试者工作特征曲线；图7是根据本发明实施例的mir-1225-5p/mir-3162-3p的受试者工作特征曲线；以及图8是根据本发明实施例的mir-1207-5p/mir-1225-5p/mir-3162-3p的受试者工作特征曲线。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1筛选老年不稳定心绞痛患者与稳定性心绞痛对照者差异表达的循环micrornas1.研究对象入组：分别入选年龄>65岁的不稳定性心绞痛患者(n＝10)以及年龄性别匹配的稳定性心绞痛患者(n＝10)。不稳定性心绞痛入选标准参照2014年acc/aha关于ua/nstemi的诊断和治疗指南，稳定性心绞痛入选标准参照2012年acc/aha慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南。排除标准：肝肾功能异常；自身免疫性疾病；恶性肿瘤；血液系统疾病。两组患者的临床特征无明显统计学差异(见表1)。表1：筛选人群中稳定性心绞痛和不稳定性心绞痛患者的临床特征2.micrornas芯片筛查循环中差异表达的micrornas：采用micrornas提取试剂盒提取血浆中总rna，高通量micrornas芯片(agilentmirnas定量芯片)检测老年不稳定心绞痛组和稳定性心绞痛对照组血浆中micrornas的表达谱，pca分析显示选取的样本代表性及生物学重复性较好(结果如图1所示)。根据热图(heat-map)和聚类(cluster)分析方法筛查差异表达的micrornas(结果如图2所示)。根据差异倍数>15，p<0.05且mirna在大部分样本(>16/20)中富含的条件进一步筛选，发现mir-21-5p、mir-1202、mir-1207-5p、mir-1225-5p、mir-3162-3p和let-7f-1-3p共6个mirna可作为疾病诊断的候选循环micrornas(见表2)。表2：筛选出的mirna的差异倍数及p值mirnap值差异倍数上调/下调mir-21-5p5.89e-0796.938385下调mir-12028.92e-0424.586685下调mir-1207-5p1.84e-0429.414928下调mir-1225-5p0.00186824720.023924下调mir-3162-3p4.38e-1588.51182上调let-7f-1-3p3.59e-0756.159626上调实施例2验证老年不稳定心绞痛患者与稳定性心绞痛对照者差异表达的循环micrornas1.研究对象入组：分别入选不稳定性心绞痛患者(n＝30)和稳定性心绞痛对照者(n＝30)。不稳定性心绞痛入选标准参照2014年acc/aha关于ua/nstemi的诊断和治疗指南；稳定性心绞痛入选标准参照2012年acc/aha慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南。排除标准：肝肾功能异常；自身免疫性疾病；恶性肿瘤；血液系统疾病。验证人群中两组患者的临床特征无明显统计学差异(见表3)。表3：验证人群中稳定性心绞痛和不稳定性心绞痛患者的临床特征2.初步验证候选差异表达的循环micrornas：采用real-timepcr的方法检测候选差异micrornas水平，在上述更大样本人群中对候选的6个循环差异micrornas进行验证。共有4个mirnas(mir-1202、mir-1207-5p、mir-1225-5p、mir-3162-3p)的验证结果与芯片结果一致(实验结果见图3)。3.进一步评价差异表达循环micrornas对于老年不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者的诊断价值：通过计算受试者工作特征曲线下面积，发现mir-3162-3p在老年不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者中有较好的诊断价值(auc＝0.790，p＝0.003)。其敏感性为76.7％，特异性为70％(结果参见图4和表4)。表4：mirna的受试者工作特征曲线(roc)及诊断敏感性和和特异性分别将mir-3162-3p与剩余3种mirna联合，绘制不同组合形式的mirna联合诊断老年不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者的受试者工作特征曲线(结果参见图5-7，其中图5是mir-1202/mir-3162-3p的受试者工作特征曲线(roc)，图6mir-1207-5p/mir-3162-3p的受试者工作特征曲线(roc)，图7mir-1225-5p/mir-3162-3p的受试者工作特征曲线(roc))，计算不同mirna联合诊断的受试者工作特征曲线下面积，及相应的敏感性、特异性(表5)。发现mir-1207-5p/mir-3162-3p和mir-1225-5p/mir-3162-3p两种方式的mirna联合诊断较mir-3162-3p单独诊断的价值更大。表5：mirna联合诊断的敏感性和特异性将联合诊断试验中诊断价值较好的mir-1207-5p、mir-1225-5p和mir-3162-3p三种mirna联合诊断，发现auc＝0.841，p<0.001，其敏感性为86.7％，特异性70％(结果见图8)；三种mirna联合诊断较两种mirna联合诊断的诊断价值提高。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>北京大学人民医院<120>试剂盒及试剂在制备试剂盒中的用途<130>pidc1169046<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>50<212>dna<213>artificial<220><223>用于识别mir-3162-3p的探针具有的核苷酸序列<400>1gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactgggga50<210>2<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>用于识别mir-3162-3p的探针具有的核苷酸序列<400>2tggggagtggaggggtaggga21<210>3<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>特异性扩增mir-3162-3p的引物所具有的核苷酸序列<400>3agcgtccctacccctccac19<210>4<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>能够特异性扩增mir-3162-3p的引物所具有的的核苷酸序列<400>4atccagtgcagggtccgagg20<210>5<211>50<212>dna<213>artificial<220><223>特异性识别mir-1207-5p的探针所具有的核苷酸序列<400>5gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccccccc50<210>6<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>特异性识别mir-1207-5p的探针所具有的核苷酸序列<400>6cccctcccagcctccctacca21<210>7<211>50<212>dna<213>artificial<220><223>特异性识别mir-1225-5p的探针所具有的核苷酸序列<400>7gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccccctc50<210>8<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>特异性识别mir-1225-5p的探针所具有的核苷酸序列<400>8ccccccactgggccgtacccac22<210>9<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>特异性扩增mir-1207-5p的引物所具有的核苷酸序列<400>9acggtgggtacggcccagt19<210>10<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>特异性扩增mir-1207-5p的引物所具有的核苷酸序列<400>10atccagtgcagggtccgagg20<210>11<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>特异性扩增mir-1225-5p的引物所具有的的核苷酸序列。<400>11gcgtggcagggaggctgg18<210>12<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>特异性扩增mir-1225-5p的引物所具有的的核苷酸序列。<400>12atccagtgcagggtccgagg20当前第1页12