一种纤细裸藻的培养方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是一种适用于对纤细裸藻进行培养的方法。

背景技术：

纤细裸藻属于裸藻门裸藻属，细胞多为纺锤形，少数为圆柱形，无细胞壁，表质软，形状易变，直径50μm，是地球上最早的生命之一，出现在5多亿年前，基因始终没有变化，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，同时又可以进行化能异养。纤细裸藻由于具有富含丰富的营养物质，并且具有可进行化能异养培养的培养模式所具有的得天独厚的优势，因此是一种兼具营养价值与工业化潜能的藻种。

纤细裸藻的主要培养方式有自养、混养和异养。目前规模化培养多采用自养，但自养存在培养密度低、生长周期长、生产效率低、占地面积大、采收困难等不利影响。而采用廉价、适宜和广泛使用的有机碳源葡萄糖为唯一碳源的培养条件下，纤细裸藻的异养培养不受光照、温度等环境和气候条件影响，生长速率快，培养密度高，生产过程容易控制，产率可大幅提高。

目前已有的异养培养方式主要为分批培养、流加分批培养和间歇式补料分批培养。其中分批培养是最普遍采用的培养方式。但分批培养存在培养过程中延滞期较长，培养达到稳定期后藻细胞老化生长减缓，以及培养末期葡萄糖浓度较高造成浪费的问题，使培养产率降低。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种培养周期短、高产率、碳源利用率高的纤细裸藻的培养方法。

本发明的技术方案是，

一种纤细裸藻的培养方法，其步骤包括：对纤细裸藻进行异养培养，在指数生长期中期，放料部分纤细裸藻，再补充部分营养物和水，继续培养。

在指数生长中期，每天进行“放料纤细裸藻，纤细裸藻的选取量为1/2（占培养液体积的50%），再补充营养物和水，营养物和水的选取量为1/2（占培养液体积的50%），继续培养”的操作一次，直到培养周期结束。

所述异养培养液的组成包括：葡萄糖 20g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₃ 0.3g/L，KH₂PO₃0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L， TE微量元素液1mL/L，其余为水，其中TE微量元素液组成包括 H₃BO₃ 2.81g/L、MnCl ₂·4H₂O 1.82g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.23g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.34g/L、CuSO₄·5H₂O 0.05g/L 以及Co(NO₃) ₂·6H₂O 0.06g/L。

所述异养培养液pH值在3.0~6.0。

所述补充营养物的组成包括每 1000mL 培养液中添加葡萄糖 4-5g，酵母粉4-5g/L，K₂HPO₃ 0.05g，KH₂PO₃ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.02g， TE 微量元素液 0.5mL。

所述异养培养过程中纤细裸藻的接种量为培养液 10％的体积占比。

所述异养培养过程中培养温度25-28℃，通空气量1.0L/min，加入0.05％的有机硅消泡剂。

所述指数生长期中期为自接种培养的第三天至第四天。

优选的，每次放料1/2（占总培养体积的1/2）的纤细裸藻。

本发明的有益效果是能够快速、高产的培养出利用率高的纤细裸藻，极大的降低了纤细裸藻的生产成本。

附图说明

图1是本发明的通气自养与异养生长曲线示意图，

图2是本发明的对数期补料生长曲线示意图。

具体实施方式：

结合以上附图详细描述实施例，

实施例 1

通气自养培养：

在 1000mL 的培养瓶中，进行通气自养培养，培养条件为：纤细裸藻接种密度为0.33g/L；异养培养基的组成包括：NaNO₃1.5g/L，K₂HPO₃0.3g/L，KH₂PO₃ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L， TE 微量元素液 1mL/L，其余为水，其中 TE 溶液配方为 H₃BO₃ 2.81g/L、MnCl ₂·4H₂O 1.82g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.23g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.34g/L、CuSO₄·5H₂O 0.05g/L以及Co(NO₃) ₂·6H₂O 0.06g/L；培养温度28℃，通空气量 1.0L/min，加入 0.05％的有机硅消泡剂。结果显示如图 1 所示。

外加碳源葡萄糖通气异养培养

在1000mL 的培养瓶中，进行外加碳源葡萄糖通气异养培养，培养条件为：纤细裸藻接种密度为0.33g/L；异养培养基的组成包括：葡萄糖20g/L，NaNO₃1.5g/L，K₂HPO₃0.3g/L，KH₂PO₃ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L， TE微量元素液 1mL/L，其余为水，其中 TE 溶液配方为 H₃BO₃2.81g/L、MnCl ₂·4H₂O 1.82g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.23g/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.34g/L、CuSO₄·5H₂O 0.05g/L 以及 Co(NO₃) ₂·6H₂O 0.06g/L；培养温度 25℃，通空气1.0L/min，加入0.05％的有机硅消泡剂。结果显示如图 1 所示。

由图1可知，采用通气自养培养的纤细裸藻，第8天通气自养培养的纤细裸藻进入稳定期，随后培养结束；采用外加碳源葡萄糖通气异养培养的纤细裸藻，培养开始后第2天纤细裸藻进入指数生长期，第6天通气异养培养的纤细裸藻进入稳定期，随后培养结束。

实施例2

通气自养培养：

在 1000mL 的培养瓶中，进行通气自养培养，培养条件为：纤细裸藻接种密度为0.33g/L；异养培养基的组成包括：NaNO₃1.5g/L，K₂HPO₃0.3g/L，KH₂PO₃ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L， TE 微量元素液 1mL/L，其余为水，其中 TE 溶液配方为 H₃BO₃ 2.81g/L、MnCl ₂·4H₂O 1.82g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.23g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.34g/L、CuSO₄·5H₂O 0.05g/L以及Co(NO₃) ₂·6H₂O 0.06g/L；培养温度 25℃，通空气量 1.0L/min，加入 0.05％的有机硅消泡剂。结果显示如图 1 所示。

外加碳源葡萄糖通气异养培养

在1000mL 的培养瓶中，进行外加碳源葡萄糖通气异养培养，培养条件为：纤细裸藻接种密度为0.33g/L；异养培养基的组成包括：葡萄糖20g/L，NaNO₃1.5g/L，K₂HPO₃0.3g/L，KH₂PO₃ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L， TE微量元素液 1mL/L，其余为水，其中 TE 溶液配方为 H₃BO₃2.81g/L、MnCl ₂·4H₂O 1.82g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.23g/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.34g/L、CuSO₄·5H₂O 0.05g/L 以及 Co(NO₃) ₂·6H₂O 0.06g/L；培养温度 28℃，通空气1.0L/min，加入0.05％的有机硅消泡剂。结果显示如图 1 所示。

由图1可知，采用通气自养培养的纤细裸藻，第8天通气自养培养的纤细裸藻进入稳定期，随后培养结束；采用外加碳源葡萄糖通气异养培养的纤细裸藻，培养开始后第2天纤细裸藻进入指数生长期，第6天通气异养培养的纤细裸藻进入稳定期，随后培养结束。

实施例3

外加碳源葡萄糖通气异养培养，在指数期前期放料补液培养。

在1000mL的培养瓶中，进行外加碳源葡萄糖通气异养培养，培养条件为：纤细裸藻接种密度为0.33g/L；异养培养基的组成包括：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₃0.3g/L，KH₂PO₃ 0.2g/L，MgSO₄·7H2O 0.1g/L， TE微量元素液 1mL/L，其余为水，其中 TE 溶液配方为 H₃BO₃2.81g/L、MnCl ₂·4H2O 1.82g/L、ZnSO₄·7H2O 0.23g/L、Na₂MoO₄·2H2O 0.34g/L、CuSO₄·5H₂O 0.05g/L 以及 Co(NO₃) ₂·6H₂O 0.06g/L；培养温度 25--28℃，通空气量1.0L/min，加入0.05％的有机硅消泡剂；在第1.5-2天开始，每天放料1/2的纤细裸藻，再补充等量营养液，继续培养，其中，所述补充营养物的组成包括：葡萄糖4-5g，酵母粉5g/L，K₂HPO₃ 0.05g，KH₂PO₃ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.02g，TE微量元素液0.5mL。在继续培养过程中，每3天注入300mg/L 的抗生素青霉素钠盐1mL，每8天为一个生产周期。结果显示如图2所示。外加碳源葡萄糖通气异养培养，在指数期中期放料补液培养。

本实验与“外加碳源葡萄糖通气异养培养，在指数期前期放料补液培养”的实验基本相同，不同之处在于，在第2.5天~第3.5天，每天放料1/2的纤细裸藻，再补充等量营养液，继续培养。结果显示如图2所示。外加碳源葡萄糖通气异养培养，在指数期后期放料补液培养。本实验与“外加碳源葡萄糖通气异养培养，在指数期前期放料补液培养”的实验基本相同，不同之处在于，在第3.5-4.5天开始，每天放料1/2的纤细裸藻，再补充等量营养液，继续培养。结果显示如图2所示。由图2可知，外加碳源葡萄糖通气异养培养，在指数期前期放料补液培养，培养液中纤细裸藻的生物量稳定在3.9-4.1g/L之间；在指数期中期放料补液培养，培养液中纤细裸藻的生物量有稳步上升的趋势，生物量基本可以稳定在 10.2-12.0g/L；在指数期后期放料补液培养，培养液中纤细裸藻的生物量在取样补料的前一天有较大幅度的下降，而后有逐渐下降的趋势，生物量基本可以稳定在8.0-8.3g/L之间。

本发明提供的纤细裸藻的培养方法在异养培养过程中，通过绢布放料取出部分藻细胞，然后补充一定体积的培养液，使藻细胞在异养培养瓶中继续培养。采用该方法，大大提高了纤细裸藻的培养产率，保证了藻细胞的活力，同时提高了碳源的利用率，有利于规模化异养生产；此外，通过放料取样，保留了培养液中的营养成分，节约生产成本，避免了浪费和环境污染，培养条件容易优化控制。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。