本发明属于水产生物技术领域中的海洋蟹类性别连锁分子标记筛选与遗传性别鉴定技术，特别涉及一种用于拟穴青蟹性别鉴定的snp位点及其鉴定方法。
背景技术：
十足目是甲壳动物中较高等的类群，包括许多重要经济虾蟹类，如：凡纳滨对虾、中国对虾、斑节对虾、中华绒螯蟹、三疣梭子蟹、拟穴青蟹等。青蟹属包含4个物种：锯缘青蟹、榄绿青蟹、紫螯青蟹、拟穴青蟹，它们广泛分布于西太平洋、东南亚、澳洲、印度洋、及非洲沿岸，是世界上养殖价值最高的海水品种之一。其中，拟穴青蟹主要分布在我国东海和南海沿岸，是我国传统的海洋渔业资源和水产养殖品种。
据中国渔业年鉴统计，我国的拟穴青蟹年养殖产量连年超过14万吨，其中，广东、福建、浙江、广西和海南是主产区。拟穴青蟹具有雌雄生长速度差异大的特点，雌性个体显著大于同期雄性个体（jiangetal.,2014），且性腺发育饱满的雌性个体的市场价值远高于雄性个体，深受消费者追捧。因此，开展拟穴青蟹全雌单性育种和人工养殖，将为水产养殖业带来更高的利润，产业发展前景巨大。但截至目前，关于拟穴青蟹性别决定机制方面的研究还十分匮乏，尚不清楚其性别决定类型。
我国学者在21世纪初便开展了拟穴青蟹染色体制备研究，表明其染色体数目为2n=98，但是并没有发现异型染色体（王桂忠等,2002;陈学雷等,2004）。采用aflp技术对拟穴青蟹雌雄个体进行性别差异dna片段筛选研究，获得了748条候选片段，但没有发现性别特异或连锁的片段（王艺磊等,2004）。通过cdna文库和测序分析，发现了一部分与拟穴青蟹性腺发育和性别分化相关的功能基因（贾锡伟等,2004;邹志华等,2009;zouetal.,2011;gaoetal.,2014），但也未找到在性别决定和分化过程中起重要作用的基因。此外，鉴定到一种抗菌肽scygonadin，它只在拟穴青蟹雄性生殖系统中特异表达，推测其可能在保护雄性生殖系统免受有害微生物侵染过程中发挥作用（wangetal.,2007）。此外，还未见关于拟穴青蟹性别连锁snp标记筛选与应用方面的研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于拟穴青蟹性别鉴定的snp位点及其鉴定方法，以解决目前无法鉴定发育早期的拟穴青蟹性别，以及无法鉴定拟穴青蟹遗传性别等问题。
一种用于拟穴青蟹性别鉴定的snp位点，碱基序列为：seqidno：1或seqidno：2，长度为285bp；所述连锁snp位点为seqidno：1或seqidno：2中第62位、第70位、第74位、第145位、第147位、第163位、第186位和第194位。
一种拟穴青蟹性别连锁snp标记的鉴定方法，主要包括以下步骤：
（1）提取拟穴青蟹雌雄个体基因组dna；
（2）构建简化基因组文库，并进行高通量测序；
（3）序列分析与筛选性别连锁的候选snp标记；
（4）采用大样本对性别连锁的候选snp标记进行验证。
进一步的，步骤（1）中所述提取拟穴青蟹雌雄个体基因组dna包括以下步骤：首先采集雌雄成蟹个体，剪取肌肉组织，在裂解液中进行匀浆；然后加入白酶k消化肌肉组织和rnasea消化rna，在50℃水浴锅中孵育2h；最后采用酚和氯仿分别抽提多次，用冰乙醇沉淀dna，在37℃保温箱中干燥dna，并溶解于无菌双蒸水中，低温保存待用。50℃有利于蛋白酶k高效率工作。
进一步的，步骤（2）中所述构建简化基因组文库与高通量测序包括以下步骤：第一，采用ecori-hf内切酶对基因组dna进行酶切；第二，采用ampurebeads磁珠吸附方法对酶切产物进行纯化，并连接接头p1，室温孵育2h；第三，采用ampurebeads磁珠吸附方法对连接产物进行纯化，并采用bioruoter超声法将连接产物打碎至350bp左右，之后连接接头p2，室温孵育2h；第四，采用割胶回收的方法纯化连接产物，再采用pcr方法富集回收产物，然后回收长度在300-500bp的pcr产物；第五，对回收产物进行高通量测序。350bp左右长度的产物有利于提高后面的pcr扩增和测序的效率。回收长度过大或过小不利于提高测序的效率。
进一步的，步骤（3）中所述序列分析与筛选性别连锁的候选snp标记包括以下步骤：第一，采用cd-hit-est对f2a个体的所有序列进行聚类、过滤，获得大量适合组装的tag和reads；第二，采用spades对每类中的reads进行局部组装，并剔除长度小于150bp的序列；第三，采用bwa将全部的reads比对到f2a个体的组装结果上，再用samtools进行群体变异检测；最后，通过比较分析雌性个体和雄性个体之间的snp变异趋势，鉴定到8个性别连锁的候选snp位点。
进一步的，步骤（4）中所述采用大样本对性别连锁的候选snp标记进行验证包括以下步骤：首先，以筛选到的285bp的性别差异dna序列为模板，设计一对pcr引物，其扩增产物大小为211bp；然后采用pcr引物对大量雌雄蟹进行pcr扩增，并且对pcr产物进行双向测序，验证snp位点。
进一步的，采用illumina测序平台的双末端150bp测序模式对回收产物进行高通量测序。从费用和效率方面讲，illumina测序最好。
进一步的，所述ecori-hf内切酶进行酶切的反应体系为40µl，包括：10xbuffer4µl、ecori-hf酶5u、dna1µg；所述p1反应体系为30µl，包括：ligationbuffer3µl、adapterp1接头0.5µl、ligase200u、酶切产物1µg；所述p2反应体系为30µl，包括：ligationbuffer3µl、adapterp2接头0.5µl、ligase200u、破碎的连接产物1µg。
进一步的，所述pcr方法中pcr反应体系30µl，包括：2xmix15µl、p1和p2引物各0.2µl、回收产物10µl；pcr反应条件为：98℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，循环15次，72℃延伸7min，10℃保存。
进一步的，所述pcr引物为：
f：5'-gcttatcatagttattgccttgt-3'
r：5'-tgcactcatgctggatttt-3'。
与现有技术相比，本发明首次鉴定到拟穴青蟹的性别连锁分子标记，一方面在拟穴青蟹性别决定和分化机制研究中具有较强的指导意义，同时在拟穴青蟹及其它蟹类的遗传性别鉴定及性别控制研究中具有较高的应用价值。本发明的技术方法具有准确、灵敏、可靠等优点，通用性强，且不需要预先知道基因组信息，不仅可应用于海水蟹类的性别连锁分子标记鉴定，还可应用于众多的无参考基因组的物种，具有广泛的推广应用潜力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
1、拟穴青蟹雌雄个体基因组dna的提取。
首先，采集拟穴青蟹成蟹115只，其中雌性63只、雄性52只。剪取步足中的肌肉组织约10g，在含300µl裂解液的ep管中进行匀浆；之后，加入终浓度为25µg/µl的蛋白酶k消化肌肉组织，同时加入终浓度为120µg/µl的rnasea消化肌肉组织中的rna，在50℃水浴锅中孵育约2h；最后，采用酚和氯仿分别抽提2次，用冰乙醇沉淀dna，在37℃保温箱中干燥dna，并溶解于无菌双蒸水中，低温保存待用。
2、简化基因组文库的构建与高通量测序。
本研究构建了10只雌蟹和10只雄蟹的简化基因组文库。首先，采用ecori-hf内切酶对每个个体的基因组dna进行酶切，反应体系为40µl，包括：10xbuffer4µl、ecori-hf酶5u、dna1µg，在37℃水浴锅中孵育约3h。第二，采用ampurebeads磁珠吸附方法对酶切产物进行纯化，并连接接头p1，反应体系为30µl，包括：ligationbuffer3µl、adapterp1接头0.5µl、ligase200u、酶切产物1µg，室温孵育约2h。第三，采用ampurebeads磁珠吸附方法对连接产物进行纯化，并采用bioruoter超声法将连接产物打碎至350bp左右，之后连接接头p2，反应体系为30µl，包括：ligationbuffer3µl、adapterp2接头0.5µl、ligase200u、破碎的连接产物1µg，室温孵育约2h。第四，采用割胶回收的方法纯化连接产物，回收产物大小控制在300-500bp，之后采用pcr方法富集回收产物，pcr反应体系30µl，包括：2xmix15µl、p1和p2引物各0.2µl、回收产物10µl。pcr反应条件为：98℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，循环15次，72℃延伸7min，10℃保存。然后回收长度在300-500bp的pcr产物。最后，采用illumina测序平台的双末端150bp测序模式对回收产物进行高通量测序。
3、序列分析及性别连锁的候选snp标记筛选。
首先，分析发现，雌性2号个体（f2a）获得的序列数目最多、序列质量最高，因此，采用cd-hit-est对f2a个体的所有序列进行聚类、过滤，获得了适合组装的tag共27.2万个及适合组装的reads共965万个。第二，采用spades对每类中的reads进行局部组装，并剔除长度小于150bp的序列，获得了24万个contigs，平均长度为288bp，n50为300bp。第三，采用bwa将全部20个个体的reads比对到f2a个体的组装结果上，再用samtools进行群体变异检测，设置如下标准：snp的最低比对质量均方根为10、最低深度为2x、变异的reads数量大于等于2。最终鉴定到178万个snp。最后，通过比较分析10个雌性个体和10个雄性个体之间的snp变异趋势，鉴定到8个性别连锁的候选snp位点，这8个位点在10个雌性个体中均呈现二等位基因杂合型，而在10个雄性个体中均呈现等位基因纯合型，分别命名为62c>t、70c>t、74c>t、145t>c、147g>a、163c>t、186a>t、194t>g。同时，还鉴定出这8个snp位点均位于长度为285bp的一条dna序列上。
4、性别连锁候选snp标记的大样本验证。
首先，以筛选到的285bp的性别差异dna序列为模板，利用软件primerpremier5.0设计了一对特异的pcr扩增引物，分别为f：5'-gcttatcatagttattgccttgt-3'和r：5'-tgcactcatgctggatttt-3'，其扩增产物大小为211bp。其次，采用上述引物对剩余的95只个体（雌性53只、雄性42只）进行pcr扩增，并对pcr产物进行双向测序。最后，通过对测序峰图的仔细校验，确定了这8个snp位点在所有雌性个体中均为杂合，而在所有雄性个体中均为纯合，从而证实这8个snp位点（62c>t、70c>t、74c>t、145t>c、147g>a、163c>t、186a>t、194t>g）是与拟穴青蟹性别完全连锁的分子标记。
sequencelisting
<110>汕头大学
<120>一种用于拟穴青蟹性别鉴定的snp位点及其鉴定方法
<130>2017
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<170>patentinversion3.3
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<212>dna
<213>未知
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