用于牛、羊x/y精子快速分离的uty抗体纳米颗粒的制备方法及应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及家畜快速扩繁领域，具体涉及一种用于牛、羊Χ/Υ精子快速分离的UTY 抗体纳米颗粒的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 家畜性别控制（性控)一旦能为人类精确掌握，畜牧业的经济效益就会成倍增长。 在正常情况下，哺乳动物由携带Υ染色体的精子(Υ精子)与卵子结合受精，这种受精卵就向 雄性发育；而由携带X染色体的精子(X精子)与卵子结合，受精卵即向雌性发育。因此，性的 发育方向取决于参加受精的精子类型，人为地选用某一类精子与卵结合受精就可以达到控 制家畜性别的目的。
[0003] 常见的性别控制方法有Χ、Υ精子分离法和早期胚胎性别鉴定法。由于早期胚胎性 别鉴定法需要从胚胎上取下少量卵裂后的细胞，或多或少会对胚胎造成一定的损伤，会导 致受胎率下降，还需要显微操作仪等昂贵的仪器设备和娴熟的显微操作技术，从而制约了 该技术的广泛应用;而Χ、γ精子分离法在受精时就可以人为控制动物的性别，避免了胚胎的 后期损伤，操作相对简单，因此只要能分离得到理想的X或Υ精子，在生产上有选择性的输精 即可控制动物后代的性别。
[0004] 流式细胞仪分离Χ/Υ精子需要昂贵的仪器设备和专业操作人员，并且精液在前期 处理时会受到紫外线照射、机械损伤等损害。采用对Υ精子具有特异性抗体进行精液分离， 由于Χ、γ精子处在同一液体环境下，极易降低分离效率，同时在常规实验条件下可对X精子 产生一定的负面作用，所以提高抗体的特异性，减少其在X精子上的聚集，有望进一步提高 Χ、γ精子分离效率。
[0005] 纳米颗粒是尺寸在1~lOOOnm的颗粒，纳米颗粒可以将抗体包裹在纳米颗粒之中 或吸附在其表面，与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全高 效的靶向抗体输送。雄性特异性组织相容性抗原(H-Y抗原)是由Y染色体上的基因编码，在 雄性动物细胞中普遍表达(包括Y型精子、胚胎和滋养层细胞）。目前采用细胞毒性T淋巴细 胞检测到H-Y抗原有多个抗原表位即抗原肽，这些肽由染色体上一段特异的DNA编码，并从 胞内蛋白分离出来，由主要组织相容性复合分子结合呈递在细胞表面。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制 备方法及应用。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008] -种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 1)构建Y精子Η-Y抗原原核表达系统，所述原核表达系统表达的目的基因为UTY基 因的编码序列；
[0010] 2)利用步骤1)构建的Y精子H-Y抗原原核表达系统制备Y精子UTY抗原重组蛋白；
[0011] 3)利用Υ精子UTY抗原重组蛋白制备抗Υ精子UTY抗原的单克隆抗体；
[0012] 4)将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，然后将酶切得到的UTY抗体的抗原结 合片段Fab '（ 即UTY抗体的Fab '片段)进行分离；
[0013] 5)制备包含Fab'片段的磷酸钙纳米颗粒。
[0014] 所述目的基因采用反转录PCR扩增得到，扩增的模板为提取自牛或羊的精子中的 总 RNA〇
[0015] 所述扩增采用的引物为：
[0016] 上游引物：5 ' -CAGAATTCACTTGGAAATTTGTTGTT-3 ' ；
[0017] 下游引物：5 ' -ATCTCGAGAAAGAGGTA ATCGTTACA-3 '。
[0018]所述原核表达系统是以Pet_28a质粒与所述目的基因经基于限制性内切酶EcoR I 及Xho I的双酶切法构建重组载体并转化宿主细胞而得到。
[0019] 所述步骤4)具体包括以下步骤:将所述单克隆抗体以及胃蛋白酶加入酶切缓冲液 中，并于37 °C酶切1~2h，所述单克隆抗体与胃蛋白酶的质量比为80~100:1，利用碘乙酸钠 终止酶切反应后通过柱层析分离得到UTY抗体的Fab '片段。
[0020] 所述步骤5)具体包括以下步骤:将分离得到的UTY抗体Fab'片段加入磷酸钙纳米 颗粒混悬液中，UTY抗体Fab'片段加入的终浓度为80~100yg/mL，然后于20~25°C条件下震 荡吸附0.5~lh，再于4~8°C条件下震荡吸附1~2h，得到包含UTY抗体Fab'片段的磷酸钙纳 米颗粒。
[0021] 所述磷酸钙纳米颗粒混悬液中的磷酸钙纳米颗粒为针状，粒径大小在50~80nm。
[0022] 上述用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒在牛、羊快速扩繁中的应用。 [0023]本发明的有益效果体现在：
[0024]本发明利用UTY抗体的Fab'片段与磷酸钙纳米颗粒制备得到UTY抗体靶向纳米颗 粒，具有在Y精子表面和进入其内部进行抗原抗体反应的能力，从而导致精液中Y精子凝集， 经过离心即可得到高比例的X精子的精液。由于1):UTY抗体Fab'片段具有相对分子质量小、 特异性强和免疫原性低等优点；以及2):磷酸钙具有生物相容性、生物降解性、可吸收性、无 毒廉价等优点。故本发明具有X、Y精子分离简单、快速、廉价及效率高等特点。与现有技术相 比，本发明制备以及分离的操作简单，不需要昂贵的仪器设备，分离后的精子中X精子的比 例达到80~95 %，且对分离得到的X精子损害极小。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例对本发明作详细说明。
[0026] 申请人经过严格对比发现抗原肽UTY在绵羊、山羊和牛上雄性来源的细胞同源性 极高，随后将其编码基因作为Η-Y抗原的候选基因，该候选基因位于Υ染色体的非重组区，仅 在雄性组织中表达。因此，实验建立了包裹单克隆抗体的纳米颗粒平台，并将针对Υ精子高 表达的UTY抗原具有高度特异性的单克隆抗体(ant i-UTY)的抗原结合片段Fab'进行分离， 然后将其和纳米颗粒交联形成UTY抗原特异性的单克隆抗体纳米颗粒。
[0027] 一.UTY抗体纳米颗粒的制备
[0028] 1.克隆UTY基因
[0029] 由于牛、绵羊和山羊之间UTY基因序列高度保守，其编码区为3319bp，编码1079个 氨基酸。因此，设计针对该基因编码区的PCR引物，就可以获得UTY基因的cDNA。同时在设计 上下游引物时，添加限制性内切酶EcoR I及Xho I双酶切位点。上游引物为5'-CA GAATTC 八(：11^6厶厶厶1'11^1^61'1'-3'，下游引物为5'-厶了 CTCGAG AAAGAGGTA ATCGTTACA-3'，引物序列 中下划线部分为酶切位点。用RNA提取试剂盒从绵羊（小尾寒羊，宝鸡市麟游县原种羊场， 2013年10月）、山羊(关中奶山羊，西北农林科技大学奶山羊场，2013年10月）和牛（中国荷斯 坦种公牛，杨凌法斯特奶牛场，2013年10月）的精子细胞中提取RNA，纯化、稀释后(分子克隆 实验指南(第4版））进行反转录PCR，将扩增结果进行DNA序列测定。结果发现三种UTY基因序 列同源性达98%以上，而氨基酸序列无差异，因此，抗体是绵羊、山羊和牛通用的。
[0030] 2.酶切Pet_28a载体并与目的基因相连
[0031]将扩增的UTY基因片段用EcoR I及Xho I双酶切，回收目的片段，与用相同限制性 内切酶消化的pET-28a载体片段按摩尔比4:1的比例，在T4DNA连接酶催化下，4°C连接过夜， 然后转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，在含卡那霉素25mg/L的LB琼脂板上置37°C温育 15h。随机挑取单个克隆，经增菌后，提取重组质粒(OMEGA质粒提取试剂盒，D6922-01)，用 EcoR I及Xho I双酶切鉴定。电泳后发现酶切鉴定结果与预期的完全一致(预期片段3290bp 和5340bp)。
[0032] 3.重组蛋白的诱导表达
[0033]将上述经酶切鉴定为阳性的重组质粒重新转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞， 挑取单个克隆，接种于5mL含卡那霉素50mg/L的LB培养液中，37°C振荡培养过夜。次日以1: 100比例(体积比）分别转接于2mL含卡那霉素50mg/L的LB培养液中，37°C继续培养3h，生长 至对数期。加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷）至终浓度0.3mmol/L，于30°C条件下诱导培养 3h，再以5000r/min离心3min收菌，收集的菌体lmL加100yL蒸馏水重悬，然后再加100yL的 loading bufTer(SDS凝胶加样缓冲液)煮沸，然后进行SDS-PAGE(5%浓缩胶，12%分离胶）， 鉴定重组质粒表达情况(根据分子克隆实验指南(第4版），鉴定依据是蛋白杂交western-blot) 。 通过 western-blot 发现诱导表达的重组蛋白 大小为llOKDa， 与预期的大小相符合。 [0034] 4.重组蛋白的纯化
[0035]将表达阳性的原菌液以1:100(体积比）的比例接种于含卡那霉素50mg/L的LB培养 液中，37°C振荡培养至A6q() = 0.5。取出培养物置室温冷却，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L， 于30°C条件下诱导培养5h。离心（5 000r/min，3min)收菌，加入roS(含0.8%NaCl，0.02% 1((：1，0.144%恥2册〇4,0.024%1012?〇4 411 = 7.6)离心漂洗菌体。将菌体沉淀重悬于211^冰预 冷的裂解