.5mg/mL)等量(体积)混合后，于25°C条件下放置5分钟，然后以500r/min离心3分钟。去掉 底部Y精子形成的胶冻状物质，将上部含有X精子的液体分成三部分(分别用于进行以下部 分2、3、4)〇
[0068] 2.流式细胞仪分选检测
[0069]先在生物学显微镜下观察精子的活率，用0.5yg/mL的Hoechst 33342将精子染色 30min，加入含4 %卵黄的TALP(参考文献[1 ])和0.002 % food dye使精子密度达到200个/ 106mL。选用基本分选指标为50psi，150mW，90%纯度，然后采用流式细胞分离仪(SX MoFlo@， DakoCytomation 1]1(^〇1'1:(]〇11;[118，(1)，1^)检测乂、￥精子的比例。结果发现检测的5个精液 样品中X精子的比例为99.3±3.2%。说明该方法分离得到的X精子比例非常高，完全可以用 于畜牧业生产上进行牛、羊后代的性别控制。
[0070] 3.体外受精及胚胎培养
[0071]从屠宰场收集山羊、绵羊及牛的卵巢，放入装有35°C灭菌生理盐水(含有青、链霉 素各100IU/mL)的保温瓶中，3h内运回实验室。用38°C灭菌生理盐水冲洗卵巢3次，用带有12 号针头的注射器抽吸卵巢表面上直径为3~8mm卵泡中的卵母细胞。在体视镜下挑出卵丘细 胞完整、卵母细胞细胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。用成熟培养液(TCM199+10% FBS+10yg/mL FSH+10yg/mL LH+lyg/mL E2)洗3次，按照常规成熟培养方法将COCs放入成熟 培养液中（用凹皿培养，覆盖石蜡)于细胞培养箱中（5 % C02、38 °C、饱和湿度)成熟培养22h。 [0072] 先将第一次离心后的上部分精子以1500r/min离心lmin，吸弃上清液，留下底部约 100yL精子沉淀，加入到140yL精子获能液(5mg/mL BSA+0 · 5mg/mL咖啡因+0 · 3mg/mL谷胱甘 肽+20yg/mL肝素）中获能处理15min，并调整精子的浓度至1~2\106个/!^，备用。将体外培 养成熟的卵丘-卵母细胞复合体用受精液洗涤3次，移入受精液(S0F+6mg/mL BSA)微滴(提 前在C〇2培养箱中放置2h)，加入已准备的精子，置培养箱中精卵共同培养20h。
[0073] 把受精处理后的卵子(卵丘-卵母细胞复合体)用SOFaa培养液(参考文献[2])洗涤 3次，移入含有SOFaa液的凹皿中培养至第2天，每隔1天半量换SOFaa培养液，继续培养至第5 天(牛胚胎继续培养至第7天）。培养条件同卵丘-卵母细胞复合体的成熟培养。
[0074] 选择小尾寒羊、关中奶山羊各18匹，中国荷斯坦奶牛12头，条件是体况接近、健康 无疾病，处于泌乳后期进行同期发情处理:关中奶山羊的处理方法参考文献[3]，小尾寒羊 的处理方法参考文献[4]，牛的处理方法参考文献[5]。撤栓12h后公羊开始试情，24h后每4 小时试情一次并记录、观察发情情况，确定发情后每头颈部肌肉注射人绒毛膜促性腺素500 单位。麻醉绑定母羊，利用腹腔镜微创手术对绵羊、山羊进行胚胎移植，随机选择两枚囊胚 移到卵巢上有黄体的一侧子宫角；如果两侧都有黄体，则每个子宫角移1枚胚胎。牛胚胎移 植采用非手术法移植(参考文献[5])。
[0075]将AntiUTYFab磷酸钙纳米颗粒处理过的精液重复受精、胚胎移植等过程3次，观察 发情并记录妊娠率和分娩率。
[0076] 表1.体外受精、胚胎移植后产羔/犊记录表
[0077]
[0078] 4.人工受精
[0079] 选择自然发情的小尾寒羊（30匹）、关中奶山羊（28匹）及荷斯坦奶牛（25头），羊采 用子宫颈口输精，牛采用传统的输精器输精。然后观察返情及妊娠情况，直到分娩。
[0080] 表2.人工受精后产羔/犊记录表
[0081]
[0082]从表1以及表2可以看出，使用该方法分离得到的绵羊、山羊和牛X精子无论是进行 体外受精还是传统的体内受精，产生雌性后代的比例都在96%以上，进一步说明本发明中 的精子分离方法对于控制牛、羊后代的性别具有实用和推广价值。
[0083] 三·参考文献
[0084] [1]Coy P,Gadea J,Romar R,et al.Effect of in vitro fertilization medium on the acrosome reaction，cortical reaction，zona pellucida hardening and in vitro development in pigs.Reproduction 2002,124,279-288.
[0085] [2]Gardner DK，Lane M，Spitzer A.et al.Enhanced rates of cleavage and development for sheep zygotes cultured to the blastocyst stage in vitro in the absence of serum and somatic celIs : amino acids , vitamins,and culturing embryos in groups stimulate development. Biol.Reprod.1994,50,390-400.
[0086] [3]田万强，等.非繁殖季节奶山羊同期发情处理效果研究[J].畜牧兽医杂志， 2014,33(6):28-31.
[0087] [4]张长兴，等.新型孕激素阴道栓一孕激素棉栓在小尾寒羊同期发情效果上的研 究[J]·畜牧与兽医，2013,45(11) :41-43.
[0088] [5]赵康，等.三种同期发情方案对奶牛胚胎移植效果的影响[J].中国奶牛，2014， 8:20-22.
【主权项】
1. 一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于:包括 以下步骤： 1) 构建Υ精子Η-Υ抗原原核表达系统，所述原核表达系统表达的目的基因为UTY基因的 编码序列； 2) 利用步骤1)构建的Υ精子Η-Υ抗原原核表达系统制备Υ精子UTY抗原重组蛋白； 3) 利用Υ精子UTY抗原重组蛋白制备抗Υ精子UTY抗原的单克隆抗体； 4) 将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，将酶切得到的UTY抗体的抗原结合片段 Fab'进行分离； 5) 制备包含Fab '片段的磷酸钙纳米颗粒。2. 根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方 法，其特征在于:所述目的基因采用反转录PCR扩增得到，扩增的模板为提取自牛或羊的精 子中的总RNA。3. 根据权利要求2所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方 法，其特征在于:所述扩增采用的引物为： 上游引物：5 ' -CAGAATTCACTTGGAAATTTGTTGTT-3 ' ； 下游引物：5 ' -ATCTCGAGAAAGAGGTA ATCGTTACA-3 '。4. 根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方 法，其特征在于:所述原核表达系统是以Pet_28a质粒与所述目的基因经基于限制性内切酶 EcoR I及Xho I的双酶切法构建重组载体并转化宿主细胞而得到。5. 根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方 法，其特征在于:所述步骤4)具体包括以下步骤:将所述单克隆抗体以及胃蛋白酶加入酶切 缓冲液中，并于37°C酶切1~2h，所述单克隆抗体与胃蛋白酶的质量比为80~100:1，利用碘 乙酸钠终止酶切反应后通过柱层析分离得到UTY抗体的Fab'片段。6. 根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方 法，其特征在于:所述步骤5)具体包括以下步骤:将分离得到的UTY抗体的Fab'片段加入磷 酸钙纳米颗粒混悬液中，所述Fab'片段加入的终浓度为80~lOOyg/mL，然后于20~25°C条 件下震荡吸附0.5~lh，再于4~8°C条件下震荡吸附1~2h，得到包含所述Fab'片段的磷酸 钙纳米颗粒。7. 根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方 法，其特征在于:所述磷酸钙纳米颗粒混悬液中的磷酸钙纳米颗粒为针状，粒径大小在50~ 80nm〇8. -种如权利要求1所述方法制备得到的用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米 颗粒在牛、羊快速扩繁中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法及应用：利用Y精子UTY抗原重组蛋白制备抗Y精子UTY抗原的单克隆抗体；将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，并分离得到抗UTY抗原的Fab’片段；制备包含Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒。本发明制备得到的UTY抗体纳米颗粒，具有在Y精子表面和进入其内部进行抗原抗体反应的能力，从而导致Y精子凝集，对X、Y精子的分离效率达到80～95％，具有X、Y精子分离简单、快速、廉价及效率高等特点，且损害极小。
【IPC分类】C12N5/076, C07K16/18, C12N15/70
【公开号】CN105646707
【申请号】
【发明人】华松, 张涌, 付明哲
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月26日