缓冲液(50mmol/L NaH2P〇4,300mmol/L NaCl，0.1mg/mL溶菌酶，lmmol/L PMSF(苯 甲基磺酰氟），pH=8.0)中，冰浴15min，超声破碎裂解细胞，输出功率为10W，2 X 50s，4°C，离 心（1 2000r/min，4 °C，30min)。收集上清液，一部分进行SDS-PAGE确定是否为重组蛋白，另 一部分上清中加入Triton X-100至终浓度2%，经孔径0.45μηι微孔滤膜过滤，再加入NaN3至 终浓度0.02%，存放于4°C。确定UTY蛋白（重组蛋白）在上清中存在后，将上清过Ni +2-NTA琼 脂糖层析柱进行纯化，具体为:先用二倍于柱体积的STE裂解液(根据分子克隆实验指南(第 4版)上的配方进行配置、保存)4mL平衡层析柱，上清以25mL/h流速过柱，用4mL洗涤缓冲液 (裂解缓冲液中另加入〇 · 1 %Tween-20、20mm〇l/L咪唑，pH = 8 · 0)洗涤，再用4mL洗脱缓冲液 (裂解缓冲液中另加入250mmol/L咪唑，pH = 8.0)洗脱结合的蛋白。取过柱成分进行SDS- PAGE，薄层分析测定蛋白纯度在85%以上，用Bradford法测定纯化后蛋白的浓度Ο . 33mg/ mL〇
[0036] 5 ·免疫动物
[0037] 将上面获得的UTY蛋白免疫小鼠：先将目的蛋白（洗脱后就得到了蛋白溶液，进一 步蒸发就是固体蛋白）溶于生理盐水，约2.0mg/mL，作为抗原。取7周龄雌性BALB/c小鼠4只， 选腹股沟和腹腔两侧为注射点，75%乙醇消毒，每只注射4个部位，每个部位皮下注射 0.05mL抗原。首次免疫以福氏完全佐剂乳化抗原，加强免疫以福氏不完全佐剂乳化，每次免 疫间隔2周，共免疫3次，最后1次免疫14d后尾静脉采血并分离血清，用间接ELISA法检测血 清抗体效价，效价达到1:16000以上进行细胞融合。融合前3d，再以每只0.02mL抗原量进行 加强免疫。
[0038] 6.细胞融合
[0039] 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，将其挤压研磨，制备脾细胞悬 液。将准备好的同系骨髓瘤细胞(Sp2/0)与小鼠脾细胞按1:3细胞个数比例混合，并加入促 融合剂聚乙二醇(PEG)，诱导淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
[0040] 7.选择培养
[0041 ]经 HAT 培养液(RPMI-164010 · 4mg/mL，丙酬酸纳0 · 1 lmg/mL，碳酸氛纳 1 · 8mg/mL，3% 的L-谷氨酰胺25yL/mL，犊牛血清150yL/mL，次磺嘌呤1.36mg/mL，胸腺嘧啶核苷0.39mg/mL， 氨基喋呤0.02mg/mL)培养3天(37 °C、5 % C02、饱和湿度），未经融合的骨髓瘤细胞相继死去， 而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落，8天后停用HAT培养液，改用HT培养基(不含氨基喋呤 的HAT培养液），再维持2周，改用一般培养液(HAT培养液不含次磺嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨 基喋呤）。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10~1/5面积时，即可开始检测特异 性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，每2天一次半量换液。
[0042] 8.杂交瘤细胞株的建立
[0043]用重组蛋白（含有His-tag)包板，以100ng/孔按行包被酶标板，按列分别加入特异 性单克隆细胞培养液(就是上一步筛选得到的杂交瘤细胞系)和阴（Sp2/0细胞上清液）、阳 (免疫小鼠血清)血清，用间接ELISA法筛选阳性克隆，阳性克隆经3次克隆化后，阳性率接近 100%。此时，一部分细胞被冻存，一部分被扩大培养。
[0044] 9.抗体制备
[0045]向健康雌性BALB/c小鼠腹腔内注射高压灭菌后的石蜡油，每只0.5mL。9天后，再向 其腹腔注射能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞(就是步骤8扩大培养的那部分），每只0.5mL(细 胞浓度为2.0 X 106个/mL)。14d后，开始收集腹腔积液，采用二氧化硅法去除脂肪和石蜡油， 收集澄清腹腔积液。
[0046] 10.间接ELISA测定腹腔积液效价
[0047]用肠激酶切除Hi S-Tag (按照肠激酶试剂盒说明进行，Sigma公司产品），包被ELI SA 板（l〇〇ng/孔），将步骤9收集的澄清腹腔积液从1:1000开始作10个梯度稀释。标记抗体为 HRP标记的羊抗鼠 IgG。间接ELI SA法检测抗体水平，使用双波长(测定波长为450nm，参考波 长为630nm)测定吸光值，0D值大于阴性对照组值2.5倍以上者为阳性。结果发现腹腔积液效 价为1〇 8以上。
[0048] 11.单克隆抗体亚型的测定
[0049] 单克隆抗体的亚型采用兔抗小鼠 I gA、I gG 1、I gG2a、I gG2b、I gG3和I gM酶标抗体的 间接ELISA试验检测（小鼠单抗Ig亚类鉴定用ELISA试剂盒为Sigma公司）。结果发现单克隆 抗体的亚型为IgGl。
[0050] 12.抗体蛋白浓度和纯度的测定
[0051] 将步骤9收集得到的澄清腹腔积液采用ProteinG柱亲和纯化获得抗体，浓度测定 采用公式0D280 X 1.45-0D260 X0.74 =蛋白（mg/mL)。抗体纯度测定采用SDS-PAGE凝胶电泳 分析。结果发现抗体浓度为1.2mg/mL，纯度在99.5 %以上。
[0052] 13.单克隆抗体的大量制备
[0053]取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5mL液体石腊进行预处理。9天后，腹腔内接种杂交 瘤细胞(0.5mL/只，细胞浓度为2.0 X 106个/mL)。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和 分泌单克隆抗体。14天后用注射器抽取腹腔积液，即可获得大量单克隆抗体，再按照上述同 样的方法(指步骤12中的方法)进行纯化和检测。
[0054] 14.Anti-UTY Fab'片段（即UTY抗体的抗原结合部位)的制备 [0055]酶切单克隆抗体：在酶切缓冲液（20mM Na2HP〇4,20mM NaH2P〇4，150mM NaCl，10mM 半胱氨酸，2mM EDTA，pH=7.0)中，单克隆抗体和pepsin(胃蛋白酶，Sigma公司）以100:1(质 量比）在37°C酶切2h。然后加入1/100(总体积1 % )的0.3M碘乙酸钠终止反应。
[0056]用Protein-G柱(金斯瑞生物科技有限公司）纯化(具体操作按照操作说明进行）， 收集流穿液。将流穿液过G25柱(缓冲液为20mM醋酸，pH=5.0)，然后过Mono-S柱:缓冲液A (binding buffer:20mM醋酸，pH=5.0);缓冲液B(elution buffer:20mM醋酸+1M NaCl，pH =5.0);按8倍柱体积，缓冲液A与B混合以缓冲液B占0 %到30 %的比例，进行梯度洗脱，收集 洗脱液，得到Anti-UTY的Fab'片段。
[0057] 15.磷酸钙纳米颗粒的制备(试剂都为Sigma公司）
[0058] 取29.5mg四水硝酸钙加入50mL双蒸水中，室温搅拌15min。然后加入2g PEG4000溶 解，并用NaOH调pH到10.0。将溶液置在室温下揽拌30min(溶液A)。取16.5mg磷酸氢二氨溶于 50mL双蒸纯水中，用NaOH调pH到10.0(溶液B)，然后将溶液B缓慢滴加到溶液A中，滴加完后 继续搅拌l〇min。将反应后的溶液在4°C，10000r/min的条件下离心20min。弃上清，将沉淀颗 粒用双蒸水洗3次，最后重悬于双蒸水中（磷酸钙纳米颗粒混悬液）。
[0059] 16.磷酸钙纳米颗粒外表分析
[0000] 采用智能型颗粒测量仪Mastersizer 3000对磷酸|丐纳米颗粒混悬液进行颗粒测 定。结果发现获得的纳米颗粒分散均匀，针状，大小在50~80nm。
[0061 ] 17.磷酸钙纳米颗粒毒性试验
[0062]将磷酸钙纳米颗粒混悬液25yL加入0.5mL精液稀释液(无水葡萄糖10g/L，柠檬酸 钠23g/L，100mL/L鲜卵黄，青、链霉素各10万单位），再将其对新鲜精液进行1:1(体积比）稀 释，同时用精液稀释液作对照，30min后观察精子活力。结果发现30min后精子活力都在0 · 7 左右，说明所获得的纳米颗粒几乎无毒性。
[0063] 18.包含Anti-UTY Fab'纳米颗粒(AntiUTY Fab磷酸|丐纳米颗粒)的制备
[0064] 磷酸钙纳米混悬液（浓度为0.1~0.6mg/mL)中加入Anti-UTY Fab'，使Anti-UTY Fab ' 终浓度分别为0、50yg/mL、100yg/mL、150yg/mL 和 200yg/mL，分别在25 °C 和4 °C 条件下摇 床震荡吸附〇、〇. 5h、lh、2h和3h，离心，弃上清，将沉淀颗粒用双蒸水洗3次，最后重悬于双蒸 水，AntiUTYFab磷酸钙纳米颗粒浓度0.5~0.8mg/mL，BCA蛋白试剂盒检测Anti-UTY Fab '的 吸附率，每个样品重复3次，筛选制备纳米磷酸钙吸附Anti-UTY Fab'的最优吸附条件为： 100yg/mL，25 °C条件下震荡吸附0.5h，再于4°C条件下震荡吸附2h。
[0065] 二.AntiUTYFab磷酸钙纳米颗粒在X、Y精子分离中的应用
[0066] 1 .AntiUTYFab磷酸|丐纳米颗粒凝固Υ精子
[0067]按照常规方法采集绵羊、山羊和牛精液，用AntiUTYFab磷酸钙纳米颗粒（浓度为 0