本发明属于生物医药技术、纳米医药及新材料领域，具体涉及含β-羧酸酰胺键的接枝共聚物的合成及其组装及应用于制备对肿瘤细胞溶酶体具有酸触发释放的智能纳米胶束载体的用途。
背景技术：
恶性肿瘤严重威胁人类的身心健康，目前临床治疗仍然以小分子药物化疗为主。小分子化疗药物在初期取得了巨大成功，但随后会产生严重的毒副作用，且具有低选择性，易耐药性等缺陷，迫使人们急需对其加以改进。科学工作者们提出了针对肿瘤微环境的药物传递系统的概念，即肿瘤组织的快速增长，导致其区别于正常组织的微环境，例如乏氧，酸性增强，温度升高，生长因子和水解蛋白酶分泌增多等。其中，ph敏感药物传递系统获得广泛研究，根据正常人体组织与肿瘤微环境ph的差异进行设计，正常人体血液的ph为7.35-7.45，而肿瘤组织的ph稍低为6.6-6.8，肿瘤细胞内涵体的ph为6.0-6.5，溶酶体的ph更低为5.0-5.5。根据这一特点，使载药系统在正常血液循环中能保持结构的相对稳定，将药物运送到肿瘤部位后在肿瘤环境低ph作用下快速降解，释放药物，从而降低对正常组织的毒副作用，提高疗效。酸不稳定酰胺键是ph敏感药物传递系统的研究热点之一，如β-羧酸酰胺，顺式乌头酰胺键。氨基与酸酐(如六氢苯酐、2,3-二甲基马来酸酐、柠康酸酐等)反应可形成β-羧基酰胺键。β-羧基酰胺键在碱性和中性环境相对稳定，而在酸性环境发生裂解，证实了β-羧基酰胺键非常适合作为酸敏感的纳米药物载体构筑单元。张建华课题组合成了甲氧基聚(乙烯乙二醇)-b-聚(ε-己内酯-co-γ-二甲基马来酰亚胺-ε-己内酯)，其聚酯片段具有酸敏感β-羧酸酰胺键，可组装成胶束。在ph6.0条件下，β-羧酸酰胺水解产生阳离子伯胺，导致电荷反转即由负转正，进而使药物快速释放(biomacromolecules2014,15,4281-4292)。阿霉素(doxorubicin,dox)是临床上广泛应用的一种细胞周期非特异性药物，对多种癌症具有显著疗效。但在长期临床使用中，发现dox具有强烈的毒副作用，尤其是心脏毒性和骨髓抑制毒性，其次对于多药耐药的肿瘤细胞，dox并不是特别敏感。技术实现要素：针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种运载dox的纳米药物传递系统，应用纳米传递系统能运载dox到达特定的部位，降低对正常组织的毒性，并在特定部位迅速释放所负载的药物dox。本发明以接枝共聚物与dox组装成纳米尺寸的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox，在血液中可实现长效循环，在肿瘤部位富集，经肿瘤细胞摄取后，能在溶酶体的酸性条件ph5.0的条件下，随着酰胺键断裂，胶束分解，成功释放出dox。本发明提出了一种含酸敏感β-羧基酰胺键的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)，所述接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)为聚(氨乙基天冬氨酸-接枝-聚乙二醇单甲醚-接枝-六氢苯酰胺)，其中所述β-羧基酰胺键为ph敏感型酰胺键；所述接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的结构如式(i)所示；式(i)中，x＝1-8，y＝1-41，m＝11-109。优选地，x＝2-4；y＝9-18；m＝40-46。所述接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)中：mpeg的接枝率dgmpeg＝17.4％，六氢苯酐的接枝率dghap＝76.9％。其中，接枝率是根据式(1)的核磁共振氢谱(1h-nmr)积分比算出的平均值，dgmpeg为接枝mpeg的单元占主链总单体的百分比，dghap为接枝六氢苯酐的单元占主链总单元的百分比。其中，所述接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的主链为poly(ae-asp)，其结构如式(3)所示式(3)中，n＝12-23。本发明还提出了一种含酸敏感β-羧基酰胺键支链的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的制备方法，包括以下步骤：(1)在溶剂中，在酸的催化作用下，式(1)所示的l-天冬氨酸发生缩聚反应，得到式(2)所示的聚琥珀酰亚胺(psi)；(2)在溶剂中，聚琥珀酰亚胺(psi)在乙二胺的作用下发生开环反应，完全开环得到式(3)所示的聚氨乙基天冬氨酸(poly(ae-asp))；(3)在溶剂中，在缚酸剂的作用下，mpeg与对硝基氯甲酸苯脂npc发生酯化反应，得到式(4)所示的聚乙二醇单甲醚活化脂(mpeg-np)；(4)在溶剂中，聚乙二醇单甲醚活化脂(mpeg-np)接枝到poly(ae-asp)的-nh2上，得到式(5)所示的聚(氨乙基天冬氨酸-接枝-聚乙二醇单甲醚)(poly(ae-asp-g-mpeg))；(5)在第一溶剂中，在催化剂的作用下，式(6)所示的六氢苯酐hap与n-羟基琥珀酰亚胺反应生成六氢苯酐nhs活性脂；在第二溶剂中，在poly(ae-asp-g-mpeg)的-nh2上继续接枝六氢苯酐nhs活性脂，得到式(i)所示的含酸敏感β-羧基酰胺键的接枝共聚物聚(氨乙基天冬氨酸-接枝-聚乙二醇单甲醚-接枝-六氢苯酰胺)(poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap))；反应过程如路线(1)所示：在一具体实施方式中，制备式(i)的步骤具体包括：称取六氢苯酐hap到无水dmf搅拌溶解，称取n-羟基琥珀酰亚胺1.3g(nhs)加入到反应瓶中，加入催化量的9mg的dmap，室温反应8h后，得到六氢苯酐nhs活性脂，浓缩混合物，加入到含1.32gpoly(ae-asp-g-mpeg)(按peg接枝率17.4％算，约有2.1mmol的-nh2)的水溶液中，反应24h，用截留分子量3500的透析袋透析混合液3d，冻干得产品接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)，产率76％。路线(1)中，n＝4-50，x＝1-8，y＝1-41，m＝11-109。优选地，n＝12-23，x＝2-4；y＝9-18；m＝40-46。步骤(1)中，所述酸选自磷酸、硫酸或对甲苯磺酸；优选地，为磷酸。步骤(1)中，所述缩聚反应的溶剂选自环丁砜(sulfolane)、1,3,5-三甲苯、dmf；优选地，为环丁砜(sulfolane)。步骤(1)中，所述l-天冬氨酸、磷酸的摩尔比为(5-15)：1；优选地，为10：1。步骤(1)中，所述缩聚反应的温度为150-180℃；优选地，为170℃。步骤(1)中，所述缩聚反应的时间为8-15h；优选地，为12h。步骤(1)中，优选在氮气保护下进行。步骤(2)中，所述开环反应的溶剂选自dmf、dmso、dcm；优选地，为dmf；进一步优选地，为无水dmf。步骤(2)中，所述psi、乙二胺的摩尔比为1：(2-4)；优选地，为1：3.6。步骤(2)中，所述开环反应的温度为0℃-50℃；优选地，为室温25℃。步骤(2)中，所述开环反应的时间为4-12h；优选地，为8h。步骤(2)中，所述乙二胺的作用为开环psi环，提供-nh2用于接枝反应。步骤(2)中，优选在氮气保护下进行。步骤(3)中，所述酯化反应的溶剂选自乙腈、dcm、dmf；优选地，为乙腈。步骤(3)中，所述缚酸剂选自三乙胺、n，n-二异丙基乙胺、吡啶；优选地，为三乙胺；所述缚酸剂的作用为促进酯化反应进行。步骤(3)中，所述mpeg、对硝基氯甲酸苯脂npc的摩尔比为1：(1-3)；优选地，为1：2。步骤(3)中，所述酯化反应的温度为-5-25℃；优选地，为0℃。步骤(3)中，所述酯化反应的时间为12-36h；优选地，为24h。步骤(4)中，所述接枝反应的溶剂选自水、甲醇、乙醇；优选地，为水，进一步优选地，为去离子水。步骤(4)中，所述poly(ae-asp)中–nh2、mpeg-np的摩尔比为(4-15)：1；优选地，为8：1。步骤(4)中，所述接枝反应的温度为0-50℃；优选地，为室温25℃。步骤(4)中，所述接枝反应的时间为12-50h；优选地，为36h。步骤(5)中，所述第一溶剂选自dmso，dcm、dmf；优选地，为dmf；进一步优选地，为无水dmf。步骤(5)中，所述催化剂选自dmap、吡啶；优选地，为dmap。所述催化剂的作用为催化形成六氢苯酐nhs活化脂。步骤(5)中，所述n-羟基琥珀酰亚胺的作用为活化六氢苯酐，形成六氢苯酐nhs活化脂。步骤(5)中，所述第二溶剂选自水、甲醇、乙醇；优选地，为去离子水。步骤(5)中，所述poly(ae-asp-g-mpeg)、原料六氢苯酐的摩尔比为1：(2-10)；优选地，为1：5。步骤(5)中，所述接枝反应的温度为0-50℃；优选地，为25℃。步骤(5)中，所述接枝反应的时间为12-40h；优选地，为36h。在本发明的一个具体实施方式中，制备所述接枝共聚物(poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap))的路线如下所示：本发明还提出了根据上述方法制备得到的含有β-羧基酰胺键的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)，其结构式如式(i)所示。本发明还提出了将所述式(i)所示的含酸敏感β-羧基酰胺键的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)用于制备药物载体(空白胶束)的应用；dls测得空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)平均粒径为98.1nm，分布较窄，单分散性好(pdi:0.111)。其中，所述药物为脂溶性药物；优选地，所述药物为脂溶性药物阿霉素。其中，所述载体为纳米胶束载体；优选地，所述纳米胶束载体为酸敏感型。其中，所述纳米胶束载体在肿瘤细胞溶酶体中具有酸响应。其中，所述肿瘤包括乳腺癌、肺癌，肝癌等，如所述肿瘤细胞可以为肺癌细胞。其中，所述纳米胶束载体的结构如图1c所示。本发明还提出了一种载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)取20mgpoly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)共聚物和4mgdox·hcl溶于0.5ml的dmso，加入4μl三乙胺，搅拌2h，至完全溶解。(2)将混合溶液滴加入搅拌速度为500rpm的5ml超纯水中，然后装入截留分子量3500的透析袋中，pbs透析48h除去未载入的药物和dmso。其反应过程如图1b所示。本发明还提出了一种由上述方法制备得到的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox；dls测得其平均粒径为77.5nm，分布较窄，单分散性好(pdi：0.102)，zeta电位为-12.34mv。符合被动靶向的要求，透射电镜(tem)证实球形胶束形貌。载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的体外释放实验结果显示，在ph7.4的条件下较为稳定，34h内累计释药量为25％，而在ph5.0条件下累计释药量为62％，证实载药胶束具有酸敏感释药性能。相对正常培养基，载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在含溶酶体弱碱的nh4cl的培养基中对a549细胞毒性显著减弱，证实中和溶酶体ph后，载药胶束的释药过程受到抑制，由此得出结论载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在细胞水平的释药，具有溶酶体ph依赖性。流式细胞仪实验结果证明，与游离dox(dox·hcl)相比，载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的吞噬量增加。本发明还提出了所述载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在制备治疗癌症的药物中的应用；所述癌症包括乳腺癌、肺癌、肝癌。本发明制备的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的被动靶向行为及快速释药过程具体可描述为：载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox，经长效循环充分实现epr效应后富集于肿瘤组织，被肿瘤细胞摄取后，在溶酶体的酸性条件ph5.0的条件下，随着酰胺键断裂，胶束分解，成功释放出dox。本发明所涉及的含β-羧基酰胺键支链的接枝共聚物的结构及载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox示意图如图1d所示，实施步骤如下：第一步：接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的合成与表征(1)l-天冬氨酸磷酸催化缩聚合成psi；(2)乙二胺完全开环psi合成poly(ae-asp)；(3)mpeg与对硝基氯甲酸苯脂npc合成聚乙二醇单甲醚活性脂mpeg-np；(4)聚乙二醇单甲醚活性脂mpeg-np接枝到poly(ae-asp)的-nh2，合成poly(ae-asp-g-mpeg)；(5)在-nh2继续接枝六氢苯酐，合成含有β-羧基酰胺键的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)。第二步：接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的降解及其纳米胶束的构筑与表征用荧光胺法对接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)在不同酸性ph值(ph6.0,ph5.5,ph5.0)和正常血液ph值(ph7.4)缓冲溶液中的氨基含量进行监测，反映聚合物的实时降解情况，对降解曲线进行动力学分析。用透析法制备poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)胶束，测定其临界胶束浓度，用动态光散射仪(dls)测定粒径大小及分布。所述poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)胶束的结构示意图如图1c所示。第三步：载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的组装及释药性能研究用透析法制备载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox并制备成冻干粉，用紫外吸收法测定载药胶束的包封率和载药量。用透射电镜(tem)观测载药胶束形貌，用动态光散射仪(dls)测定粒径大小及分布，在不同酸性ph值(ph6.0,ph5.5,ph5.0)和正常血液ph值(ph7.4)中进行载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的释药性能研究。第四步：载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的细胞毒性研究。噻唑蓝(mtt)比色法检测载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox，dox·hcl，载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox分别在正常培养基和含20，30，40，50mmnh4cl培养基中测试对a549的细胞毒性。第五步：载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的细胞吞噬。研究mcf-7对poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox胶束的吞噬行为，以dox·hcl做对照，分别培养2，4和24h后，用pbs洗去细胞表面含药物的培养基，用流式细胞仪测量细胞吞噬载药胶束和dox·hcl的荧光值。本发明的有益效果在于，本发明含β-羧基酰胺键的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)以酸敏感β-羧酸酰胺键为支链，以乙二胺对聚琥珀酰亚胺(psi)的开环产物聚氨乙基天冬氨酸(poly(ae-asp))为主链，接枝六氢苯酐和mpeg-2000。本发明还公开了制备所述接枝共聚物的方法，包括(1)l-天冬氨酸磷酸催化缩聚合成psi；(2)乙二胺完全开环psi合成poly(ae-asp)；(3)mpeg与对硝基氯甲酸苯脂npc合成聚乙二醇单甲醚活化脂mpeg-np；(4)聚乙二醇单甲醚活化脂mpeg-np接枝到poly(ae-asp)的-nh2，合成poly(ae-asp-g-mpeg)；(5)在-nh2继续接枝六氢苯酐，合成含有六氢苯酰胺键的接枝共聚物(poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)。本发明制备的接枝共聚物在中性条件下稳定，随ph降低，酰胺键断裂速度加快。本发明的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)可以进一步用于构建载阿霉素纳米胶束载体(poly(asp-g-mpeg-g-hap)·dox)，其在酸性条件下具有较好的释药性，较低的细胞毒性和良好的细胞吞噬性；本发明利用β-羧基酰胺键对肿瘤细胞溶酶体ph5.0的响应性，选择接枝六氢苯酐，以其疏水性六元环作为内核，包裹疏水性药物阿霉素。并且β-cooh与dox的-nh2间的正负电荷吸引提高载药量，稳定载药胶束。选择生物相容性好的mpeg作为亲水链段，合成聚(氨乙基天冬氨酸-接枝-甲氧基聚乙二醇-接枝-六氢苯酰胺)(poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap))，进而构建其载阿霉素胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox。研究其体外毒性及抗癌活性。附图说明图1：a为载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的形成以及在肿瘤细胞溶酶体酸性ph条件下胶束解体，释放阿霉素的过程示意图；b为载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的制备过程示意图；c为空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的结构示意图；d为载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的结构示意图。图2为用荧光胺法测得的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)在醋酸缓冲溶液(ph5.5，ph5.0，10mm，)或磷酸缓冲液(ph7.4，ph6.0，10mm)的酸降解曲线图(mean±sd,n＝3)。图3为接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)在ph5.0的醋酸缓冲液中降解曲线动力学分析，-ln(1-dp)与时间t的线性回归图。图4为用dls测定空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的散射光强度随浓度变化曲线，突变点即为cmc，计算为0.166。图5为空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)和载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的粒径分布(dls图)。图6为载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox透射电镜形貌图。图7阿霉素在480nm处紫外吸收值对浓度的标准曲线。图8载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在不同ph缓冲溶液中的药物释放行为。在ph7.4介质中，药物释放速度较慢，34h内累计释药量约为25％。随着介质ph降低释药量明显增加，在ph5.0介质中，34h内释放量高达62％，约为同时刻ph7.4条件下的2.5倍。图9为空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)、dox·hcl和载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在正常培养基条件下，以及载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在含40mmnh4cl培养基条件下的细胞毒性。图10为dox·hcl和载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在2，4和24h时mcf-7中荧光含量平均值的统计图。具体实施方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。实施例1聚琥珀酰亚胺psi的合成称取l-天冬氨酸13.3g(0.1mmol)均匀分散到35ml的环丁砜中，加入0.5ml磷酸作为催化剂，在氮气保护下，170℃反应12h，反应液过滤后，将滤液逐滴滴加到300ml的甲醇中，过滤洗涤数次后得到淡黄色固体，50℃真空干燥48h，产率87％。所述psi的结构如式(2’)所示；式(2’)中，n＝12-23。实施例2聚氨乙基天冬氨酸poly(ae-asp)的合成取实施例1制备的psi5g(0.05mol单体)加入含有50ml无水处理的dmf的中，氮气保护下，缓慢滴加到12ml乙二胺(0.18mol)中，室温下搅拌8h，反应液过滤后，滤液浓缩后用甲醇溶解，滴加到冷乙醚中，重沉淀3次，得到淡黄色固体，产率79％。所述poly(ae-asp)的结构式如式(3’)所示；式(3’)中，n＝12-23。实施例3聚乙二醇单甲醚活化脂(mpeg-np)的合成称取干燥的mpeg-20005g(2.5mmol)和三乙胺0.7ml(5mmol)加入含有50ml乙腈的三颈烧瓶中，然后称取对硝基氯甲酸苯脂npc1g(5mmol)溶于15ml乙腈，逐滴加到烧瓶中，混合物在0℃下反应24h，然后冷却到-20℃，12h沉淀出三乙胺的盐，滤液用乙醚沉淀得到终产物mpeg-np。所述mpeg-np的结构式如式(4’)所示；式(4’)中，m＝40-46。实施例4聚(氨乙基天冬氨酸-接枝-聚乙二醇单甲醚)poly(ae-asp-g-mpeg)的合成取实施例2制备的poly(ae-asp)0.63g(4mmol–nh2)溶解在15ml去离子水中，加入到50ml的圆底烧瓶中，称取实施例3制备的mpeg-np1.1g(0.5mmolnp)加入到烧瓶中，室温反应36h，反应结束后转移到截留分子量3500的透析袋中，去离子水每6h换一次，透析3天后冻干得到poly(ae-asp-g-mpeg)固体，产率83％。mpeg的接枝率为17.4％。所述poly(ae-asp-g-mpeg)的结构式如式(5’)所示；式(5’)中，x＝2-4，y＝10-19，m＝40-46。实施例5聚(氨乙基天冬氨酸-接枝-聚乙二醇单甲醚-接枝-六氢苯酰胺)poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的合成在溶剂中，在poly(ae-asp-g-mpeg)的-nh2上继续接枝式(6)所示的六氢苯酐(hap)，合成式(i)所示的含酸敏感β-羧基酰胺键的接枝共聚物聚(氨乙基天冬氨酸-接枝-聚乙二醇单甲醚-接枝-六氢苯酰胺)(poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap))；反应过程如路线(1)所示。称取六氢苯酐hap1.54g(10mmol)到50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水dmf搅拌溶解，称取n-羟基琥珀酰亚胺1.3g(nhs，11.3mmol)加入到反应瓶中，加入催化量的9mg的dmap，室温反应8h后浓缩，加入到含1.32gpoly(ae-asp-g-mpeg)(按peg接枝率17.4％算，约有2.1mmol的-nh2)的水溶液中，反应24h，用截留分子量3500的透析袋透析混合液3d，冻干得产品接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)，产率76％。所述接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的结构式如式(i’)所示；式(i’)中，x＝2-4，y＝9-18，m＝40-46。实施例6接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的酸降解性能。用荧光胺法测定聚合物的-nh2含量变化量，随着酰胺键的断裂，氨基浓度升高，荧光强度增强，进而计算酰胺键的降解率。待测样品用去离子水溶解制成1mg/ml的溶液，取100μl的样品溶液与100μl的醋酸缓冲溶液(ph5.5，ph5.0，10mm，不含nacl)或者磷酸缓冲液(ph7.4，ph6.0，10mm，不含nacl)在37℃孵化，每隔1h然后取10μl的该溶液用100μl的ph9.1的硼酸缓冲液稀释，在混合物中加入10μl荧光胺的dmf溶液(2mg/ml)，在室温下孵化10min。用酶标仪在激发波长为390nm，发射波长为465nm测其荧光强度。将样品与0.01m的hcl孵化过夜的吸收值作为100％降解。实验结果如图2所示，用ph7.4，ph6.0，ph5.5，ph5.0的缓冲溶液分别模拟正常血液，肿瘤细胞外，内涵体，溶酶体的ph，结果显示ph7.4条件下，36h酰胺键的降解量仅为17.2％，随着ph值减小，酸性越强，酰胺键断裂越快越彻底，在ph5.0条件下，同时刻的降解量达到93.0％，结果表明接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)具有显著的酸敏感特性。为更清晰的比较ph变化对酰胺键断裂的影响，本发明对降解曲线进行分析，发现其符合一级降解动力学方程，如图3所示，以在ph＝5.0的缓冲液中的降解为例，根据一级降解动力学方程推导出，-ln(1-dp)＝kt，dp代表t时刻的降解百分率，代入数据作图发现，近似为一条过原点的直线，通过线性回归及相关性分析，得出k＝0.0706，相关系数r2＝0.9945。用同样的方法分别对接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)在ph＝7.4，ph＝6.0及ph＝5.5条件下的降解情况进行分析，均符合一级降解动力学方程。计算其降解半衰期t1/2分别为142.86h(ph＝7.4)，32.90h(ph＝6.0)，11.85h(ph＝5.5)，10.07h(ph＝5.0)。进一步说明本发明的接枝共聚物在ph＝7.4时相对稳定，随ph降低，酰胺键断裂越迅速，具有酸敏感特性。实施例7临界胶束浓度(cmc)的测定将实施例5新鲜制备的空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)溶液逐级稀释至2，1，0.5，0.2，0.1，0.05，0.02，0.01，0.005，0.002，0.001mg/ml十个浓度，按照浓度从小到大，依次用dls测定3次。做出散射光强度随浓度变化曲线图，用十字外推法得到其临界胶束浓度。实验结果如图4所示，散射光强度主要跟溶液中胶束粒子的粒径和浓度有关。在cmc浓度以上，溶液中的胶束粒子均一性好，粒子粒径几乎是一个定值(100nm左右)，此时随着胶束浓度增大，粒子浓度增加，散射光强度增强。在cmc浓度以下，测得粒径大且质量不符合测试要求，证明溶液中并没有胶束粒子存在，此时的散射光强度值极小(50kcps左右)。通过十字外推法可得到本发明poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的临界胶束浓度为0.166mg/ml实施例8空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的组装及粒径测试取20mg实施例5制备的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)溶于0.5ml的dmso中，完全溶解后吸入1ml注射剂中，以20μl/min的速度缓慢注射入搅拌速度为500rpm的5ml超纯水中，稳定2h后装入截留分子量3500的透析袋中，4℃透析48h除去dmso即得空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)。置于4℃冰箱保存，长时间保存需制成空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)冻干粉。采用dls对新鲜制备的空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的平均粒径，粒径分布，zeta电位及多分散性指数(pdi)进行测试。实验结果如图5所示，dls测得空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)平均粒径为98.1nm，分布较窄，单分散性好(pdi:0.111)。证明该空白胶束符合被动靶向的要求。研究表明，表面为正电荷的粒子易与血浆中蛋白发生相互作用而聚成，zeta电位测试结果-9.28mv(未附图)，其电负性的表面可以帮助胶束载体内长循环。实施例9载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的制备、粒径测试及形貌研究取20mg实施例5制备的接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)和4mgdox·hcl溶于0.5ml的dmso，加入4μl三乙胺，搅拌2h，将混合溶液滴加入搅拌速度为500rpm的5ml超纯水中，然后装入截留分子量3500的透析袋中，pbs透析48h除去未载入的药物和dmso，注意避光，冷冻干燥，制得载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox冻干粉。采用dls对新鲜制备的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的平均粒径，粒径分布，zeta电位及多分散性指数(pdi)进行测试。采用透射电子显微镜(tem)观察载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的形貌。实验结果如图5所示，dls测得载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的平均粒径为77.5nm，分布较窄，单分散性好(pdi:0.102)。zeta电位测试结果为-12.34mv。载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox与空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)相比，粒径有20nm的皱缩，可能是dox的-nh2和接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的侧链-cooh产生正负电荷吸引，载入dox后，增大了胶束内核的疏水性，使胶束内核变得更加紧密，同时这种正负电荷吸引的作用也增大了载药量。如图6所示，是载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的透射电镜(tem)形貌图。从图中可看出该组装体为球形胶束，经过标尺计算tem上显示粒径约在55nm。略小于dls的粒径数据，原因可能是dls在水溶液中测得的胶束粒径，tem是自然挥干后的胶束粒径，所以有约20nm的差值。实施例10载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的载药量和包封率的测定取5mg制备的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox冻干粉用dmso溶解，用紫外分光光度计测该溶液在480nm的吸收值，测定等浓度梯度dox的dmso溶液的吸收值，绘制吸光度值与浓度的标准曲线，代入得到dmso溶液中的dox的浓度，进而计算得到载药胶束的载药量和包封率。载药量dlc(wt％)＝(载入的药物质量/胶束的质量)×100％包封率dle(％)＝(载入的药物质量/投入的药物质量)×100％。实验结果如图7所示，将紫外分光光度计检测其在480nm处的吸光度值，代入阿霉素吸光值对浓度做的标准曲线y＝0.0199x+0.0164，r2＝0.99933中，计算得到载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的载药量dlc＝8.83％，包封率dle＝39.69％，如表1所示。该数据表明，由于dox的-nh2和接枝共聚物poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)的侧链-cooh产生正负电荷吸引，能提高载药量。且载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在水溶液中溶解性好，改善了dox的水溶性。表1理论载药量(wt％)载药量(wt％)包封率(％)20％8.83％39.69％实施例11载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在不用介质中的释药行为研究将1ml新鲜制备的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox装入截留分子量1000的透析袋中，并放到25ml的棕色小瓶中，在37℃，分别加入10ml的醋酸缓冲溶液(ph5.5，ph5.0，10mm)或磷酸缓冲液(ph7.4，ph6.0，10mm)，在预设的时间间隔，取出释放液，换上对应新鲜缓冲溶液，用紫外分光光度计测得各组释放液的吸光度，与dox标准曲线对照，计算各组累计释药量。实验结果如图8所示，ph7.4条件下，34h内dox累计释药量为25％，而随着ph值的降低，载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox对dox的释放量逐渐增加，且释药越来越快；当ph5.0条件下，34h内dox累计释药量为62％，以β-酰胺键为连接键的酸敏感载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在各ph条件下的释药行为充分显示了其在药物传递系统中的应用前景。实施例12载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox对人非小细胞肺癌细胞a549细胞毒性试验本发明运用噻唑蓝(mtt)比色法进一步研究载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox对人非小细胞肺癌细胞a549的细胞毒性。对空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)、载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox及dox·hcl分别在正常培养基(含10％fbs，1％双抗，f12培养基)和含20，30，40和50mmnh4cl培养基条件下进行非小细胞肺癌细胞a549毒性测试。实验方法为：步骤1.将培养5代以上的a549细胞按照5000个/孔的细胞浓度均匀按180μl/孔的接种到96孔板中，并置于37℃，含5％co2的潮湿环境下培养24h后。步骤2.吸去旧培养基，分别加入新鲜的正常培养基和含20，30，40和50mmnh4cl的培养基，在正常培养基组加入20μl含有一系列不同浓度的空白胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap(空白胶束浓度为0.008，0.016，0.033，0.065，0.130，0.260，0.530，1.060mg/ml)；在正常培养基和含nh4cl的培养基组分别加入20μl载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox及20μldox·hcl，加入培养基之前的浓度以dox的含量计分别为0.8，1.6，3.2，6.4，12.8，25.6，51.2和102.4μg/ml(加入培养基后，浓度分别为0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56，5.12和10.24μg/ml)，每个浓度设定6个孔。继续培养48h后。步骤3.加入10μl/孔mtt的pbs溶液(5mg/ml)，作用4h后，加入50μl/孔的三联液(10％十二烷基硫酸钠+5％异丁醇+0.01mol/lhcl)，37℃过夜，充分裂解细胞。步骤4.用酶标仪测定波长570nm处的吸光度od值，并根据以下公式计算各组a549细胞的生存率：cellviability(100％)＝[(odsample-odblank)/(odcontrol-odblank)]×100％odsample：实验组的od值odblank：空白组的od值，即步骤1加入180μl不含细胞的纯培养基，其他操作如上。odcontrol：对照组的od值，即步骤2加入20μl的不含药的纯培养基，其他操作如上。实验结果如图9所示，空白胶束的细胞生存率均在95％以上(空白胶束的测试浓度为0.008-1.06mg/ml，图9仅给出最大浓度1.06mg/ml时的生存率为95.66±14.88％，证实其低毒性特点。对于载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox和dox·hcl，随dox浓度升高，a549细胞的生存率降低，显示出浓度依赖性的杀伤效果。本发明在含20，30，40和50mmnh4cl培养基条件下进行a549细胞毒性测试。nh4cl是一种常用的溶酶体弱碱，有文献报道用含nh4cl的培养基培养细胞能显著提高细胞溶酶体的ph。实验结果如图9所示，其中，dox·hcl在正常培养基组和含nh4cl的培养基组(图中为未显示)的细胞毒性没有明显差异，实验数据几乎相同。相对于正常培养基组，载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox在含nh4cl培养基中的细胞生存率均明显提高，尤其是含40mmnh4cl的差异最明显(图9中仅给出含40mmnh4cl培养基组的实验结果，20，30，40mmnh4cl组在表2中以ic50值给出)。当dox浓度为1.28mg/l时，在95％的置信区间内，载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox与载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox+40mmnh4cl组比较，p<0.0001，具有显著性差异。如表2所示，为更深入的研究载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox及dox·hcl对人非小细胞肺癌a549的细胞毒性差异，分别计算了他们的半数致死量(ic50)值。载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox(ic50＝1.426)与dox·hcl(ic50＝0.9575)相比，略有提高，可能因为dox·hcl通过自由扩散进入细胞核，直接杀伤细胞。载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox需经过溶酶体酸性条件裂解释放，才能进入细胞核，因此，毒性略微降低。载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox加入nh4cl的实验组ic50，相对于正常培养组来说，均显著提高，尤其是载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox+40mmnh4cl组(ic50＝4.389)是正常培养组(ic50＝1.426)的3倍，显著降低了载药胶束对a549的细胞毒性。因为溶酶体弱碱nh4cl中和了溶酶体的ph，导致酰胺键不能降解，胶束不能破裂，dox不能释放，进而细胞生存率显著提高，ic50值显著增大。实验结果进一步验证了载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox胶束的溶酶体ph5.0释药依赖性的特性。酰胺键具有良好的ph响应性，载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox具备良好的应用前景。表2实施例13载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox细胞吞噬试验采用流式细胞仪对mcf-7细胞的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox和dox·hcl的细胞吞噬量进行研究，细胞培养方法：将mcf-7细胞接种于六孔板上预培养24h(20×104个/孔,2ml/孔)，每孔分别加入1ml含有1μg/mldox的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox及dox·hcl，设定药物作用时间为2，4和24h，对照组加入1ml正常培养基培养。作用完毕后，用胰酶消化各组细胞，转移到离心管中，用ph7.4的pbs缓冲液清洗3次，最后用pbs配制成300-800个cell/μl，转移到96孔板中，阿霉素是一种自发荧光物质，发射荧光峰值在575nm左右，可用于检测定量。用流式细胞仪对各组的荧光量进行测定并分析各组的荧光强度。实验结果如图10所示，不加药的对照组，几乎没有荧光，相应的平均荧光强度值(mfi)只有2.44，属于细胞本身的荧光强度。培养2h和4h时，载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox的mfi的均大于dox·hcl，尤其是4h是更明显，根据实施例11和实施例12推测，此时大量的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox仍在溶酶体中没有完全降解，大多数细胞仍存活，因此显示强dox荧光。而小分子药物通过扩散进入细胞内，直接进入细胞核杀伤肿瘤细胞，当细胞生存状态变差时，细胞的贴壁能力减弱，很容易在样品处理过程中，随pbs被洗掉，因此检测到的荧光强度低于同时刻下的载药胶束组。此外，培养24h时，检测到dox·hcl的mfi值略大于载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox，细胞内dox药量相对减少的原因是随着时间延长，大量积累在溶酶体中的载阿霉素纳米胶束poly(ae-asp-g-mpeg-g-hap)·dox，酰胺键断裂，大量的dox被释放出来，并随着溶酶体破裂，导致细胞大量死亡，因此检测到的荧光强度低于同时刻的dox·hcl组。本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。当前第1页12