本发明属于基于生物医用高分子材料的药物输运领域，主要涉及一类由脂肪族聚酯、聚磷酸酯合成的嵌段共聚物，以及由此类嵌段共聚物在水溶液中形成的纳米颗粒，以及该聚合物及纳米颗粒为基础的纳米药物载体。该纳米载体具有良好的生物相容性和可降解性，主要适用于体内药物输送，也可用于基因转染载体、生物造影剂的开发等其它领域。
背景技术
恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，已经成为我国居民死亡的重要原因，对我国社会和经济发展危害巨大。传统化疗由于缺乏肿瘤特异性、耐药等问题，对于常见实体瘤一般仅能达到20-30％的有效率；并且对人体正常组织有毒副作用。高分子纳米药物递送系统可以保护药物分子，增加药物体内稳定性，延长药物血液半衰期，能够将化疗药物高效输送至肿瘤病灶部位，提高药物在肿瘤部位的富集，减少了正常部位的药物浓度，提高了药物的疗效。这些优势使得纳米载体药物在肿瘤治疗中突显出极大的应用潜力。
生物可降解高分子在药物输运中具有很好的应用前景，原因是生物可降解高分子可以在生物体内降解，其降解产物或被排出体外，或参与生命体代谢，从而可以减少副作用。合成生物可降解高分子包括聚己内酯、聚酸酐等在内的大量可降解高分子，这些高分子在药物输运、基因传递、细胞培养和组织工程等生物医用领域获得了广泛的应用。聚磷酸酯是一类由磷酸酯键连接主链结构单元的可降解高分子材料，最早用作阻燃材料，聚磷酸酯具有很好的亲水性，可作为纳米颗粒的亲水壳层，延长颗粒的体内循环。如上海药物所李亚平研究员等采用聚磷酸酯-聚己内酯嵌段聚合物作为药物输送载体，揭示了聚磷酸酯单独形成亲水壳时对纳米颗粒的体内循环存在促进作用。聚磷酸酯类材料丰富的可控合成方法和多变的结构能够满足纳米载体亲水壳层特性调控的需求，具有明显的优势。
技术实现要素：
本发明提供了一种聚磷酸酯-聚已内酯嵌段共聚物，由所述共聚物形成的纳米颗粒及其制备方法，系统研究了所述纳米颗粒的体内命运以及载药纳米颗粒在肿瘤治疗中的运用。
本发明提供制备本发明的嵌段共聚物的方法，其包括用甲苯做溶剂，合成聚己内酯(pcl)；在溶剂苯、二氯甲烷、四氢呋喃中，制备mep；四氢呋喃为溶剂，以pcl-oh为大分子引发剂，异辛酸亚锡为催化剂，通过环状磷酸酯单体的开环聚合反应聚合得到pcl-b-pmep嵌段共聚物。
本发明提供的聚磷酸酯-聚己内酯两嵌段共聚物可以自组装形成纳米颗粒，这种纳米颗粒的粒径在40nm左右，表面电荷在-14mv左右。该纳米颗粒能够有效地包载药物(如多西紫杉醇)以形成稳定的纳米药物，将药物高效输送至肿瘤部位，并取得了良好的肿瘤治疗效果。
本发明得到了一种聚磷酸酯-聚已内酯嵌段共聚物，使用的聚合反应条件温和，原料易得，反应后纯化过程简便；该类聚合物组装形成纳米颗粒后，能够实现体内长循环和肿瘤组织富集，可用于化疗药物的包载及其体内输送，并且有效抑制肿瘤的增长。该纳米颗粒在输送化疗药物用于肿瘤治疗中具有良好的应用前景。
本发明的合成方法的优势在于，反应得到很好的控制，分散度更低，可以很好的控制疏水嵌段和亲水嵌段的长度，达到颗粒最后的稳定。
通过本发明的方法制备的本发明的颗粒的优势在于：相比于已报道的pcl-b-peep纳米药物载体，本发明中pcl-b-pmep自组装形成的纳米药物载体具有更加亲水的聚磷酸酯外壳，因而具有更好的稳定性。已有研究表明，纳米药物载体的表面亲水性显著影响其表面蛋白冠的形成，进而影响载体在体内与巨噬细胞的相互作用。表面亲水性较高的载体表面会吸附较少的蛋白，从而更少地被巨噬细胞摄取。本发明中的pcl-b-pmep相比较于pcl-b-peep蛋白吸附量更少，因此更不容易被巨噬细胞清除，从而表现出了更长的血液循环时间和更高的肿瘤富集量。pcl-b-pmep作为纳米药物载体用于肿瘤药物递送表现出了更加优异的性能，在肿瘤治疗领域具有更好的应用前景。
更具体地，本发明提供以下各项：
1.一种由聚磷酸酯和聚ε-己内酯组成的二嵌段共聚物，所述二嵌段共聚物由下式表示，其中聚ε-己内酯嵌段的聚合度x为15-186(对应的数均分子量为1710-21,200)，聚磷酸酯嵌段的聚合度y为7-200(对应的数均分子量为1,060-30,285)
2.根据1所述的共聚物，其中x为22并且y为62。
3.一种纳米颗粒，其由根据1或2所述的共聚物组装而成。
4.根据3所述的纳米颗粒用于制备药物载体的用途。
5.一种药物递送系统，其包含根据3所述的纳米颗粒以及由所述纳米颗粒负载的活性成分。
6.根据5所述的系统，其中所述活性成分是用于治疗癌症的药物。
7.根据6所述的系统，其中所述癌症选自乳腺癌和肺癌。
8.根据6所述的系统，其中所述药物是多西紫杉醇。
9.用于制备根据1所述的共聚物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)利用ε-己内酯、引发剂苯甲醇及催化剂异辛酸亚锡制备单端羟基的聚ε-己内酯大分子引发剂；
b)通过三氯化磷与乙二醇反应制备2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(cop)，然后将cop与甲醇反应制备2-甲氧基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(mep)；以及
c)在溶剂四氢呋喃和催化剂异辛酸亚锡存在下，使所述单端羟基的聚ε-己内酯大分子引发剂与mep进行嵌段共聚反应。
10.用于制备根据3所述的纳米颗粒的方法，所述方法包括使根据1或2所述的共聚物自组装成纳米颗粒。
附图说明
当结合附图时通过阅读下列详细说明能够更容易地理解本发明的上述方面和许多伴随的优点，其中：
图1提供了在实施例1中的pcl-b-pmep的合成路线图；
图2提供了在实施例1中的pcl-b-pmep的1hnmr谱；
图3提供了在实施例1中的pcl-b-pmep的gpc谱；
图4(a)提供了在实施例2中的pcl-b-pmep纳米载体的粒径；
图4(b)提供了在实施例2中的pcl-b-pmep纳米载体的表面电势；
图4(c)提供了在实施例2中的pcl-b-pmep纳米载体的冷冻透射电镜照片；
图4(d)提供了在实施例2中的pcl-b-pmep纳米载体在血清中的稳定性；
图5提供了在实施例2中的包载多西紫杉醇的pcl-b-pmep纳米胶束在磷酸缓冲液中，累计释放多西紫杉醇的曲线；
图6提供了在实施例3中的用dio荧光标记的胶束纳米颗粒在进入mda-mb-231细胞后分布的激光共聚焦显微镜照片；
图7提供了在实施例3中不同浓度pcl-b-pmep纳米颗粒的细胞毒性；
图8(a)提供了在实施例4中通过尾静脉注射胶束纳米颗粒pcl-b-pmep到icr小鼠中后，活体小动物成像对不同时间点小鼠血液中近红外染料dir荧光标记的纳米载体进行定量；
图8(b)提供了在实施例4中基于图8(a)得到的药时曲线；
图9(a)提供了在实施例4中通过尾静脉注射胶束纳米颗粒pcl-b-pmep到mda-mb-231乳腺癌小鼠中后，活体小动物成像表征dir标记的纳米载体不同时间在肿瘤富集和清除情况；
图9(b)提供了在实施例4中通过尾静脉注射胶束纳米颗粒pcl-b-pmep到mda-mb-231乳腺癌小鼠中后，各个脏器dir荧光强度的定量分析；
图10(a)提供了在实施例5的mda-mb-231乳腺癌实体肿瘤模型中，尾静脉注射包载多西紫杉醇的胶束纳米颗粒进入小鼠体内后，对肿瘤生长的抑制效果曲线；
图10(b)提供了在实施例5的mda-mb-231乳腺癌实体肿瘤模型中，尾静脉注射包载多西紫杉醇的胶束纳米颗粒进入小鼠体内后，通过22天治疗以后，各组的肿瘤重量对比；
图11(a)提供了在实施例5中的b16黑色素瘤转移模型中，尾静脉注射包载多西紫杉醇的胶束纳米颗粒进入小鼠体内后，通过20天治疗以后，小鼠的生长曲线图；
图11(b)提供了在实施例5中的b16黑色素瘤转移模型中，尾静脉注射包载多西紫杉醇的胶束纳米颗粒进入小鼠体内后，通过20天治疗以后，小鼠肺部转移照片；
图11(c)提供了在实施例5中的b16黑色素瘤转移模型中，尾静脉注射包载多西紫杉醇的胶束纳米颗粒进入小鼠体内后，第20天小鼠肺部h&e染色的照片。
具体实施方式
本发明借助于下列实验例来更好的理解，它们说明了本发明的嵌段共聚物的合成方法和纳米载体的制备方法，及其作为药物载体的性质。这些实施例仅仅是举例说明，不是本发明的整个反映。
实施例1、pcl-b-pmep嵌段共聚物的合成
本发明提供了ab型嵌段聚磷酸酯-聚己内酯共聚物，本发明中的b嵌段pmep，为亲水性聚磷酸酯，其相对分子量是1,060-3,0285。本发明中的a嵌段pcl，为疏水性脂肪族聚酯，其相对分子量为3,080-2,1200。它的优点在于：①相对疏水性，因此在聚合物链之间的疏水-疏水相互作用促进共聚物自组装；②可生物降解；③无毒的和生物相容的；④合成简单且可控。
具有各种分子量的端羟基pcl大分子引发剂在thf溶剂条件下通过己内酯环状单体在苯甲醇引发、异辛酸亚锡的催化条件下的开环聚合反应得到。以单端羟基的聚己内酯为大分子引发剂、异辛酸亚锡为催化剂合成了一系列pcl-b-pmep嵌段共聚物。因其高催化效率及无毒性，异辛酸亚锡是被最广泛应用的用于内酯及交酯环状单体开环聚合反应的催化剂，已被美国fda批准作为食品添加剂。图1是pcl-b-pmep嵌段共聚物的合物路线。
ε-己内酯(cl)于室温条件下用氢化钙干燥48小时减压蒸馏。苯甲醇使用前减压蒸馏。异辛酸亚锡减压蒸馏后与溶剂甲苯共沸两次再减压蒸馏。四氢呋喃与钠-钾合金处理后在氮气气氛下蒸出。
mep的制备：首先通过三氯化磷与乙二醇反应合成2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholane,cop)，然后cop与甲醇反应合成2-甲氧基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(mep)，具体的合成方法如下：
在1000ml的三口圆底烧瓶中，将三氯化磷(3.0mol)溶解于溶剂无水二氯甲烷(500ml)中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴入乙二醇(3.0mol)，待全部滴完后，继续反应0.5小时，减压下蒸去溶剂，连续减压蒸馏两次将产物2-氯-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(cdp)蒸出(50℃,200pa)。将产物溶解在溶剂苯中，通入o2反应48小时，减压下蒸出溶剂苯，再于减压下连续蒸馏两次将产物cop蒸出(88-89℃，20pa)，在n2气氛下于1℃冰箱中封存。
在一个干燥的1000ml三口烧瓶中，用注射器依次加入0.3mol甲醇，0.3mol的三乙胺(用于除去反应产生的hcl)和500ml的溶剂四氢呋喃(thf)，将体系冷却到-5℃后，边搅拌边用恒压滴液漏斗缓慢加入cop的四氢呋喃溶液(0.154molcop溶于100ml四氢呋喃)，约1小时滴完，体系在-5℃再反应24小时。将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下抽掉溶剂，于减压条件下蒸馏(92-94℃，20pa)两次纯化。
单端羟基的聚己内酯大分子引发剂的制备在手套箱中将cl(17.35g，0.152mol)，引发剂苯甲醇(0.0498g，0.604mmol)及催化剂异辛酸亚锡sn(oct)2(0.145g，0.302mmol)加入到干燥的圆底烧瓶中。于130℃的油浴中加热5小时后溶解于氯仿，沉淀于冷的正己烷中。过滤，沉淀物于真空下干燥至恒重，产率88％。通过反应投料加入不同量的己内酯cl并延长反应时间可以得到不同分子量的pcl。
嵌段共聚是在35℃下，四氢呋喃为溶剂，以pcl-oh为大分子引发剂，异辛酸亚锡为催化剂，通过环状磷酸酯单体的开环聚合反应聚合得到的。在mep及pcl-oh的干燥的四氢呋喃溶液中加入异辛酸亚锡，反应3小时后浓缩再沉淀于冷的乙醚中。沉淀物于真空下干燥至恒重，产率80％。
嵌段共聚物的组成通过1hnmr进行分析，测定其分子结构和数均分子量，它证实了该嵌段共聚物含有pcl和pmep嵌段，用gpc对聚合物的分子量及分子量分布进行了表征。图3给出了一个典型的大分子引发剂及嵌段共聚物的gpc叠加物。如图所示，共聚物的gpc图为单峰，而没有pcl大分子引发剂的峰，表明pcl大分子引发剂已完全消耗且得到了pcl-b-pmep嵌段共聚物结构。
实施例2、纳米颗粒(以下简称nps)的制备及性能评价
一、纳米颗粒的制备
两亲性嵌段共聚物在水溶液中会由于疏水段的疏水相互作用，自组装形成纳米颗粒。制备纳米颗粒的方法有多种，我们用的是透析法。通过透析法制备纳米颗粒：将10mg制备的pcl-b-pmep嵌段共聚物溶于1mln，n-二甲基甲酰胺中，然后在快速搅拌下以60ml/h的速度滴入5ml超纯水，再搅拌10min后，透析除去有机溶剂，最后定容到5ml，得到浓度为2mg/ml的纳米颗粒溶液。载药纳米颗粒的制备是在加水前投入1mg多西紫杉醇，充分搅拌使体系混匀，其余操作同上；荧光标记的纳米颗粒的制备是在加水前投入25μgdio或dir荧光染料，充分搅拌使体系混匀，其余操作同上。
二、纳米颗粒的形态
利用透射电子显微镜观察pcl-b-pmep共聚物所形成的纳米颗粒的形态。如图4(c)所示，由图可见，pcl-b-pmep共聚物所形成的纳米颗粒呈现规整的球形结构，粒径约为40nm且大小分布均一。
三、纳米颗粒的粒径和表面电势
将浓度为2mg/ml的纳米颗粒溶液稀释10倍，malvernzetasizernanaozs90动态光散射仪在25℃条件下检测时溶液纳米颗粒的粒径和粒径分布。设置三次重复试验，结果使用malverndispersiontechnologysoftware4.2软件进行分析并取平均值。
图4(a)为纳米颗粒的粒径，颗粒强度统计下的平均直径为40nm左右；图4(b)为纳米颗粒的表面电势，表面电势为-14mv。
四、纳米颗粒的血清稳定性
将0.05ml胎牛血清(fbs)添加到0.45ml1mg/ml的纳米颗粒溶液中，在37℃共同孵育不同时间，使用动态光散射仪监测纳米颗粒的平粒径。由图4(d)可见纳米颗粒的尺寸在50h以内几乎没有变化。说明该模拟的体内条件下非常稳定。
五、纳米颗粒对药物的释放能力
药物体外释放实验在37℃于磷酸缓冲液(pbs，0.02m，ph＝7.4)中进行，具体操作如下：包载化疗药多西紫杉醇的载药纳米颗粒用磷酸缓冲液重悬，纳米颗粒的终浓度为1.0mg/ml；取3份3ml的溶液直接置于透析管中(
实施例3、纳米颗粒作为药物载体在细胞水平的性能评价
一、激光扫描共聚焦显微镜观察纳米颗粒进入mda-mb-231细胞的能力
通过观察dio标记的纳米颗粒进入mda-mb-231细胞的情况。具体方法如下：
1)将mda-mb-231细胞以每孔8×104个细胞的密度种植在含有圆形盖玻片的24孔板中，使用500μldmem培养基，置于37℃、5％co2培养箱培养24h；
2)去除培养基，换入新的含有dio标记的纳米颗粒的dmem完全培养基，在37℃条件下与细胞共培养4h；
3)去除培养液，使用pbs清洗两遍，加入1ml4％多聚甲醛(ph7.4，溶解在pbs中)，室温固定15min；
4)去除多聚甲醛溶液，使用pbs清洗两遍，加入200μl1％tritonx-100穿膜5min；
5)使用pbs清洗两遍，加入alexa
6)使用pbs清洗两遍，加入dapi染液室温染色2min；
7)使用pbs清洗两遍，将盖玻片带有细胞的一面倒扣在含有一滴抗荧光淬灭封片剂的载玻片上封片；
8)使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内荧光，显微镜的型号为carlzeisslsm710，德国。
如图6所示，蓝色荧光为dapi染的细胞核，红色荧光为alexa568染的细胞骨架，而绿色荧光则为dio标记的纳米颗粒。可以看到，在培养4h后，能在mda-mb-231细胞内观察到绿色荧光标记的纳米颗粒，表明纳米颗粒能够被肿瘤细胞摄取。
二、载药纳米颗粒的生物药效评价
使用mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)比色法检测负载dtxl的纳米颗粒对乳腺癌细胞mda-mb-231(购自atcc)的杀伤能力。具体步骤如下：细胞以10000个/孔的密度种于96孔细胞培养板中，每孔中加入100μldmem培养基(10％胎牛血清)，置于co2培养箱中(37℃，co2浓度为5％)培养48小时后，将载药纳米颗粒用完全培养基稀释到不同的浓度(100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.12μm、1.56μm、0.78μm、0.39μm和0.19μm总计10个浓度梯度)，并与mda-mb-231细胞共同培养48小时后于每孔中加入25μlmtt溶液(5mg/ml溶于水溶液中)。继续培养4h后，吸出培养液，在每孔中加入100μl二甲亚砜，37℃放置10min；用bio-rad酶标仪在490nm下测定孔中溶液的吸光值。用以下公式计算细胞活力：
其中abs为溶液在490nm的吸光值。ic50表示为通过mtt方法检测的细胞死亡一半时的药物浓度。
用同样浓度的free多西紫杉醇(dtxl)作为对照。结果见图7。由图可见，当纳米颗粒携载的dtxl浓度为100μm时，超过98％的细胞死亡，而游离药物组仍有约40％左右细胞死亡，证明载药的纳米制剂具有更强的肿瘤细胞杀伤能力。
实施例4、纳米颗粒血液循环、肿瘤富集的情况
一、药代动力学评价
27只雄性icr小鼠(6-8周)随机分配为9组，每组3只。将用近红外染料dir标记的纳米颗粒通过尾静脉注射至小鼠体内。在体内循环0.083、0.5、1、2、4、8、12、24、48小时，每个时间点每组取出3只小鼠，通过眼眶取血的方法收集血液至肝素钠抗凝管中，并立即通过5000rpm、4℃离心10min，收集上层血浆样品至干净ep管中。取100μl血浆样品，用活体小动物成像对不同时间点小鼠血液中近红外染料dir标记的纳米载体进行定量。结果如图8(a)所示，纳米颗粒在血液中没有被快速清除；图8(b)药代动力学曲线显示，在注射48小时后，仍有超过1％纳米颗粒在血液中循环，这是由于纳米颗粒表面pmep分子的高度亲水性起到稳定纳米颗粒的作用，并且在纳米颗粒表面形成水化层，有效抵抗血清蛋白的吸附，逃避机体免疫系统的清除，从而延长了纳米颗粒在血液中的循环时间。
二、肿瘤富集的情况
纳米颗粒在血液中有较长的循环时间为纳米颗粒通过epr效应在肿瘤部位富集提供了机会。因此我们接下来评估纳米颗粒经静脉注射后在mda-mb-231肿瘤组织的富集情况。
将近红外染料dir标记的纳米颗粒通过尾静脉注射至3只裸鼠中用小动物活体成像仪
从图9(a)结果上看，纳米颗粒随着时间延长逐渐在肿瘤部位累计，并在24小时达到最大富集量，随后由于清除作用缓慢降低。在24小时以后的时间点肿瘤部位的纳米颗粒平均荧光强度均大于其它部位，说明了该纳米颗粒具有良好的肿瘤富集作用。从图9(b)各脏器和肿瘤部位的荧光成像结果可以看出，还纳米颗粒在肿瘤部位的平均荧光强度仅次于具有强大清除能力的肝脏，进一步证明了该纳米颗粒良好的肿瘤富集作用。这归功于纳米颗粒在血液中具备的长的循环时间，为纳米颗粒通过“epr”效应到达肿瘤组织提供了更多的机会。
实施例5、载药纳米颗粒对原位乳腺癌小鼠肿瘤生长的抑制
原位乳腺癌小鼠肿瘤模型建立：
首先进行mda-mb-231细胞的大规模培养，在准备接种前使用无血清dmem(hyclone)培养细胞6小时，胰酶消化后1000rpm离心收集细胞，用pbs重悬细胞使其密度达到2.5×107/ml，将200μl细胞悬液注射至balb/cnu裸鼠右侧第二个乳腺的脂肪垫下。原位接种乳腺癌细胞的裸鼠在spf级动物房中饲养约10天左右可形成可见肿瘤。肿瘤的体积按照公式：v＝0.5×a×b2计算，其中a是指肿瘤较长的直径，b是指肿瘤较短的直径。
肿瘤细胞接种后第十天，裸鼠的肿瘤体积达到约50mm3，将其随机分成六组并开始进行治疗。每组5只裸鼠，按照下面的处理方法进行给药：
pbs：每只裸鼠通过尾静脉注射200μlpbs，作为对照。
emptynp：每只裸鼠通过尾静脉注射200μl未载药颗粒，作为对照。
freedtxl(1mg/kg)：每只裸鼠通过尾静脉注射200μldtxl溶液。dtxl的剂量为1mg/kg小鼠体重。
np@dtxl(1mg/kg)：每只裸鼠通过尾静脉注射150μl载dtxl的纳米颗粒，给药剂量换算为dtxl的剂量为1mg/kg小鼠体重。
freedtxl(2mg/kg)：每只裸鼠通过尾静脉注射200μldtxl溶液。dtxl的剂量为2mg/kg小鼠体重。
np@dtxl(1mg/kg)：每只裸鼠通过尾静脉注射150μl载dtxl的纳米颗粒，给药剂量换算为dtxl的剂量为2mg/kg小鼠体重。
在治疗开始前期，每隔一天对肿瘤体积进行一次测量，使用游标卡尺检测垂直方向上的两个直径分别作为肿瘤的长和宽，实验后期由于肿瘤体积变化较大，每天对肿瘤体积测量一次，实施例结果如图10(a)所示，图10(b)是治疗结束后处死并解剖小鼠，将肿瘤从小鼠体内取出后称重得到的肿瘤重量对比图，pbs和空白颗粒对肿瘤的生长均没有抑制作用、dtxl作为现在应用广泛的癌症化疗药物具有一定的肿瘤生长抑制作用，但只在2mg/kg剂量下表现出显著的治疗效果。而np@dtxl无论在2mg/kg还是1mg/kg剂量下均表现出显著的治疗效果，且在2mg/kg剂量下，最终肿瘤几乎消失。由此可见，该纳米颗粒递送dtxl具有良好的肿瘤生长抑制效果。
实施例6、载药纳米颗粒对b16黑色素瘤生长的抑制
采用尾静脉注入2×105黑色素瘤细胞b16至c57/bl6鼠，建立黑色素瘤转移模型。四天后，将荷瘤的c57/bl6鼠随机分成3组，每组10只。在第10、13、16、19、22、25天，通过如下方法给药：
1)pbs组：指定时间通过尾静脉注射200μlpbs缓冲溶液；
2)dtxl组：指定时间通过尾静脉注射200μldtxl的pbs溶液，其中，dtxl的给药剂量为3mg/kg小鼠体重。
3)np@dtxl组：指定时间通过尾静脉注射200μl载dtxl的np溶液，给药剂量为3mg/kg小鼠体重。
接种后每天观察小鼠状态，给药后20天随机从每组中取3只鼠处死，解剖小鼠，将肿瘤从小鼠体内取出后先进行拍照然后用4％多聚甲醛对组织进行固定，切片后用h&e染色，观察肺部转移情况，其余鼠处于濒死状态时处死。
图11(a)表示在整个治疗期间小鼠的生长曲线；pbs组治疗30天后全部死亡，dtxl组治疗33天后全部死亡，载药纳米颗粒组治疗90天时还有25％的小鼠存活；图11(b)表示治疗20天后小鼠整个肺部的转移照片；图11(c)表示治疗20天后各处理组肿瘤组织切片经h&e染色的结果。可以很清楚的看出经pbs处理的肿瘤组织中转移肿瘤组织占正常组织约50％，dtxl组肺部转移肿瘤组织比例降低至25％左右，载dtxl的纳米颗粒组肺部只发现比例少于5％的肿瘤转移灶，说明载药纳米颗粒对黑色素瘤转移肿瘤也具有良好的治疗效果。