本发明涉及赖氨酸脱羧酶突变体及其应用，具体而言，本发明涉及对赖氨酸脱羧酶进行改造，以使其适宜用于微生物发酵生产l-赖氨酸并偶联催化l-赖氨酸脱羧反应生成1,5-戊二胺，以利用葡萄糖一步法生产1,5-戊二胺。
背景技术：
赖氨酸脱羧酶(l-lysinedecarboxylase,简称ldc,ec4.1.1.18)广泛存在于微生物、昆虫、动物和高等植物中，其可以将l-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和co2。而1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。目前，微生物法1,5-戊二胺生产主要采用以下两种方法：微生物发酵生产和微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺。中国专利申请cn105441497a通过构建结构为(iptg/乳糖)可诱导型启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的表达盒，使得赖氨酸脱羧酶基因大量分泌表达。首先通过可以高产l-赖氨酸的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌菌株利用葡萄糖发酵生产l-赖氨酸，再通过加入iptg/乳糖等诱导剂诱导赖氨酸脱羧酶分泌表达，催化l-赖氨酸转化为尸胺。这样可以实现利用葡萄糖一步法生产1,5-戊二胺，即微生物发酵生产l-赖氨酸并偶联催化l-赖氨酸脱羧反应生成1,5-戊二胺。但该系统除了需要额外添加iptg/乳糖外，泄漏表达的情况也比较严重，由于菌体本身耐受的1,5-戊二胺浓度有限，如果发酵体系中前期表达了赖氨酸脱羧酶转化生成的1,5-戊二胺过多，就会对菌体造成毒害，从而抑制菌体生长及利用葡萄糖生产l-赖氨酸的过程(qian,etal.,biotechnol.bioeng.2011；108:93–103)。在葡萄糖一步法生产1,5-戊二胺的过程中，如果使用组成型启动子，可以有效的节省发酵过程中添加的诱导剂的成本，但必须控制赖氨酸脱羧酶的表达量，否则发酵前期产生的1,5-戊二胺会严重抑制菌体的生长，使得发酵过程中断。如果可以尝试降低表达的赖氨酸脱羧酶的活性，使得前期所生成的1,5-戊二胺不会对菌体生长及利用葡萄糖生产l-赖氨酸的过程产生抑制效应，长此以往，菌体在培养过程中也会产生对1,5-戊二胺的耐受性，实现最后赖氨酸向1,5-戊二胺的充分转化。但同时必须保证剩余的l-赖氨酸不能太多，否则一方面赖氨酸会阻遏赖氨酸合成相关的酶的活性，另一方面在一步法生产1,5-戊二胺发酵结束后，必须再额外添加大量的赖氨酸脱羧酶将剩余的l-赖氨酸转化完。为了筛选到赖氨酸脱羧酶活性适宜的突变蛋白，可以采用非理性设计的方法，其不需要了解酶的空间结构和催化机制，通过将酶蛋白的基因克隆到一个合适的表达载体中，再利用基因突变的方法，在体外改造酶基因的序列，并通过合适的酶活性检测方法，来获得具有预期表型的突变蛋白。易错pcr或合成随机引物对基因进行扩增是比较简便、有效的对目的基因进行随机突变的方法。易错pcr的原理是采用taqpcr扩增酶对目的基因进行扩增时，对反应体系进行调整(例如在反应体系中加入mn2+，增加mg2+，并改变加入到体系中的4种dntps的浓度，或者改变taq酶的浓度等等)，使得目的基因在扩增过程中引入一定量的突变，然后通过合适的高通量筛选方法获得具有目的表型的突变蛋白。本领域存在对具有适宜活性的赖氨酸脱羧酶突变蛋白的需求。技术实现要素：本发明的第一方面涉及一种赖氨酸脱羧酶突变体，其具有相对于野生型赖氨酸脱羧酶或其来源的赖氨酸脱羧酶母体而言降低的赖氨酸脱羧酶活性，优选地，具有相对于野生型赖氨酸脱羧酶或其来源的赖氨酸脱羧酶母体13％～72％的赖氨酸脱羧酶活性，更优选地，46％～64％。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶突变体为大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶，优选地，野生型赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列如seqidno：1所示，优选地，野生型赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列如seqidno：2所示。在一些实施方案中，所述赖氨酸脱羧酶突变体包含选自位置84、470、330的1个、2个或3个的氨基酸取代修饰，优选地，其中n84位点的突变选自丙氨酸(a)、精氨酸(r)、天冬氨酸(d)、半胱氨酸(c)、组氨酸(h)、谷氨酸(e)、谷氨酰胺(q)、甘氨酸(g)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、赖氨酸(k)、甲硫氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、脯氨酸(p)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)或缬氨酸(v)，和/或，优选地，其中d330位点或d470的突变选自丙氨酸(a)、精氨酸(r)、天冬酰胺(n)、半胱氨酸(c)、组氨酸(h)、谷氨酸(e)、谷氨酰胺(q)、甘氨酸(g)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、赖氨酸(k)、甲硫氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、脯氨酸(p)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)或缬氨酸(v)，优选地，所述赖氨酸脱羧酶突变体包含选自n84e、d470c、d330e的1个、2个或3个的氨基酸取代修饰，或选自n84q、d470c、d330e的1个、2个或3个的氨基酸取代修饰，其中氨基酸位置根据seqidno：1所示的氨基酸序列进行编号。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶突变体的氨基酸序列如seqidno：4、6、8或10所示，或者赖氨酸脱羧酶突变体的氨基酸序列与seqidno：4、6、8或10所示的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性且仍具有降低的赖氨酸脱羧酶活性，或者赖氨酸脱羧酶突变体的氨基酸序列是在seqidno：4、6、8或10所示的氨基酸序列上取代、添加和/或缺失一个或多个氨基酸残基且仍具有降低的赖氨酸脱羧酶活性的那些突变体。本发明的第二方面涉及一种多核苷酸，其编码第一方面所述的赖氨酸脱羧酶突变体，优选地，所述多核苷酸的序列如seqidno：3、5、7或9所示，或者所述多核苷酸的序列与seqidno：3、5、7或9所示的核苷酸序列具有至少85％的序列同一性且仍编码具有降低的赖氨酸脱羧酶活性的赖氨酸脱羧酶突变体，或者所述多核苷酸在严谨性条件下与seqidno：3、5、7或9所示的核苷酸序列至少部分杂交，如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高。本发明的第三方面涉及一种重组质粒，其包含有效连接其中的第二方面所述的多核苷酸，优选地，所述重组质粒为重组表达质粒，更优选地，所述重组质粒的骨架为puc或pbr322质粒或其衍生质粒。本发明的第四方面涉及一种重组细胞，其包含第二方面所述的多核苷酸或第三方面所述的重组质粒，优选地，所述重组细胞为微生物，更优选地，所述重组细胞为大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌。本发明的第五方面涉及一种l-赖氨酸生产菌株，其能够生产l-赖氨酸并含有第二方面所述的多核苷酸或第三方面所述的重组质粒，优选地，所述生产菌株为微生物，更优选地，所述生产菌株为大肠杆菌。本发明的第六方面涉及一种组合物，其包含第一方面所述的赖氨酸脱羧酶突变体、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的重组质粒、第四方面所述的重组细胞和/或第五方面所述的l-赖氨酸生产菌株。本发明的第七方面涉及第一方面所述的赖氨酸脱羧酶突变体的制备方法，其包括步骤：1)对野生型赖氨酸脱羧酶编码基因或赖氨酸脱羧酶母体编码基因进行随机突变，获得突变体文库，优选地，所述随机突变为利用易错pcr对目的基因进行扩增的方法；2)将获得的突变体文库转化宿主细胞并利用高通量筛选技术筛选脱羧酶活性降低的突变体，优选地，所述高通量筛选利用赖氨酸脱羧酶转化赖氨酸脱羧过程中ph会升高的现象，优选地，利用酸碱指示剂指示ph的变化。本发明的第八方面涉及一种生产1,5-戊二胺的方法，其使用第一方面所述的赖氨酸脱羧酶突变体、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的重组质粒、第四方面所述的重组细胞和/或第五方面所述的l-赖氨酸生产菌株进行，优选地，其使用第五方面所述的l-赖氨酸生产菌株进行。换言之，本发明通过随机突变如易错pcr的方法对赖氨酸脱羧酶基因进行随机突变，并结合高通量筛选的方法，筛选到赖氨酸脱羧酶中关键氨基酸位点发生突变的突变蛋白，其活性相比野生型出现降低，并将含有这些突变位点的赖氨酸脱羧酶转化入l-赖氨酸生产菌株中，从而实现微生物菌株在一步法利用葡萄糖生产1,5-戊二胺的过程中减少1,5-戊二胺对微生物细胞利用葡萄糖生产l-赖氨酸的毒害作用，提高1,5-戊二胺的产量，对工业生产将会有重要的意义和帮助。在一个实施方案中，本发明以大肠杆菌mg1655k12(escherichiacolimg1655k12)的基因组为模板，克隆出赖氨酸脱羧酶基因cada(seqidno：2)，并将其构建到合适的载体如puc或pbr322中，并通过pcr的方法对其5’端进行优化，使其可以在大肠杆菌如escherichiacolibl21或蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)中成功表达。进而利用随机突变的方法对赖氨酸脱羧酶基因cada进行突变，并通过高通量筛选的方法获得四种赖氨酸脱羧酶活性降低的突变cada蛋白。通过测序的方法鉴定出导致突变蛋白活性相对于野生型赖氨酸脱羧酶发生显著下降的赖氨酸脱羧酶关键氨基酸突变的位点分别为n84e、n84q、d470c和/或d330e。进一步将可以表达这些突变赖氨酸脱羧酶的重组质粒转化至l-赖氨酸生产菌株中，利用重组l-赖氨酸生产菌株进行一步法发酵，可以显著提高其生产1,5-戊二胺的产量。本发明的有益效果：本发明应用随机突变和高通量筛选的方法，利用赖氨酸脱羧酶转化赖氨酸脱羧过程中反应体系ph会升高的现象，直观地筛选到赖氨酸脱羧酶活性下降(为野生型赖氨酸脱羧酶活性的13％～72％)的突变菌株和突变型赖氨酸脱羧酶表达质粒，含有这些突变质粒的重组l-赖氨酸生产菌株在后续利用葡萄糖一步法生产1,5-戊二胺的过程中可以有效的保证前期生成较低量的1,5-戊二胺，因此在发酵前期减少1,5-戊二胺对菌体利用葡萄糖发酵时对菌体生长的毒性作用，维持产l-赖氨酸和产1,5-戊二胺之间的平衡，最终可以提高l-赖氨酸生产菌株一步法生产1,5-戊二胺的产量(提高25％～62％)，同时剩余的l-赖氨酸可达到少于2.2g/l，最低可达到少于1.0g/l。附图说明图1、显示了野生型与突变菌株赖氨酸脱羧酶cada的sds-page电泳分析。图2、显示了不同浓度1,5-戊二胺对菌体生长的抑制曲线。具体实施方式本发明中涉及如下定义：本发明中所使用的碱基序列、核苷酸、氨基酸(单字母)的缩写，是基于国际理论和应用化学联合会及国际生物联合会对生物化学命名的规定，可参考europeanjournalofbiochemistry1984年底138卷第9期的＂准备含碱基序列和氨基酸序列的说明书的指导＂一文中的缩写，以及在生物
技术领域：
中通用的缩写。氨基酸位点的突变表示方法：用原始氨基酸-氨基酸位置-突变后的氨基酸来表示突变的氨基酸位点。本发明中对赖氨酸脱羧酶氨基酸位置的编号参照大肠杆菌的cada蛋白进行，其氨基酸序列可参考seqidno：1，因此，如n84q表示赖氨酸脱羧酶蛋白序列中的第84位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺，位置编号84对应于seqidno:1中赖氨酸脱羧酶蛋白的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，编码赖氨酸脱羧酶(ldc)的基因可以来自微生物、动物或植物的细胞，包括但不局限于大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、嗜碱芽孢杆菌(bacillushalodurans)、天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)、蜂房哈夫尼菌(h.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)、奥克西托克雷白杆菌(klebsiellaoxytoca)等。赖氨酸脱羧酶也可以来自于上述菌株经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。优选来自于大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶基因cada/ldci(seqidno:2)。赖氨酸脱羧酶还可以是上述来源的赖氨酸脱羧酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段(保留了赖氨酸脱羧酶活性的截短形式的蛋白片段)。本发明的赖氨酸脱羧酶突变体具有相对于野生型赖氨酸脱羧酶或其来源的赖氨酸脱羧酶母体而言降低的赖氨酸脱羧酶活性，优选地，具有相对于野生型赖氨酸脱羧酶或其来源的赖氨酸脱羧酶母体13％～72％的赖氨酸脱羧酶活性，例如，20～70％、30～68％、35～66％或40～65％，更优选地，46％～64％，例如，46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、55％、60％、61％、62％、63％或64％。本发明的实验数据表明n84、d470和/或d330是赖氨酸脱羧酶的酶活性中起关键作用的位点，这三个位点的氨基酸发生突变后都可能会导致其酶活性降低。在一些实施方案中，所述突变不是保守突变。所述保守突变是指其中氨基酸被其它具有类似性质的氨基酸所替换，使得肽化学领域中技术人员可预期多肽的二级结构和亲水(hydropathic)性质基本上不发生变化。氨基酸替换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一些实施方案中，所述三个位点的氨基酸仅有一个被替换。在一些实施方案中，所述三个位点的氨基酸有两个被替换。在一些实施方案中，所述三个位点的氨基酸都被替换。在一些实施方案中，所述替换为d470c或n84q。赖氨酸脱羧酶突变体来源的赖氨酸脱羧酶母体是指赖氨酸脱羧酶突变体是在现有的赖氨酸脱羧酶的基础上进一步进行突变获得的，该现有的赖氨酸脱羧酶也许是野生型的，也许已经经历了某种突变或改造。“序列同一性”是指在序列比对和引入缺口(如果必要的话，以获得最大百分比同源性)后，多核苷酸或多肽序列突变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在一些实施方案中，多肽突变体与本文所述的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.58％、至少99.72％或至少99.86％的多肽同一性。在一些实施方案中，多核苷酸变体与本文所述的多核苷酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.58％、至少99.63％、至少99.67％、至少99.72％、至少99.77％、至少99.81％、至少99.86％或至少99.95％的多核苷酸同一性。本领域技术人员知晓，上述序列同一性分别基于赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列和核苷酸序列计算而来，由于不能整除，因此，均为约数，这样的约数与其对应的精确计算值是对应的，具有相同的意义。例如，当其氨基酸序列发生一个取代替换时，序列同一性的准确值为99.86014％，对应于上述的至少99.86％。当其核苷酸序列发生一个取代替换时，序列同一性的准确值为99.9534451％，对应于上述的至少99.95％。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述核苷酸序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。密码子使用表是本领域公知的。本发明的一些实施方案提供了能够在中度至高度严谨性条件下与本发明提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。杂交技术是分子生物学领域公知的。为了说明的目的，用于测试本发明的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的合适中等严谨性条件包括在5×ssc、0.5％sds、1.0mmedta(ph8.0)的溶液中预洗；在50-60℃、5×ssc、过夜(16h)的条件下杂交；再于65℃下20分钟用含0.1％sds的2×、0.5×和0.2×的ssc各洗涤两次。本领域技术人员理解，可容易地操纵杂交的严谨性，例如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。例如，在另一个实施方式中，合适的高严谨性杂交条件包括上述的条件，所不同的是杂交温度升高了，例如达到60-65℃或65-70℃。在一些实施方案中，构建的含有编码赖氨酸脱羧酶基因的重组表达质粒载体由在宿主细胞中可复制的骨架质粒衍生而成。可复制的骨架质粒可以是能够在宿主菌中复制的任何一种质粒，在其中一个实施方案中，稳定的重组表达质粒可以是由一个可以在大肠杆菌和哈夫尼菌中复制的骨架质粒衍生而来，骨架质粒包括但不局限于puc例如puc18和puc19、pbr322质粒和它们的衍生质粒。本发明所用的术语“有效连接”是指这样的连接方式，其中所述多核苷酸置于载体的适当位置，使得所述多核苷酸正确地、顺利地复制、转录或表达。在一些实施案例中，对编码赖氨酸脱羧酶基因进行随机突变采用的是易错pcr的方法；在对筛选到的突变株进行重复验证时，可以通过定点突变的方法对关键氨基酸位点进行突变。其中随机突变属于非理性设计的方法，其不需要了解酶的空间结构和催化机制，通过将酶蛋白的基因克隆到一个合适的表达载体中，再利用基因突变的方法，在体外改造酶基因的序列，并通过合适的酶活性检测方法，来获得具有预期表型的突变蛋白。易错pcr对基因进行扩增是比较简便、有效的对目的基因进行随机突变的方法。易错pcr的原理是采用taqpcr扩增酶对目的基因进行扩增时，对反应体系进行调整(例如在反应体系中加入mn2+，增加mg2+，并改变加入到体系中的4种dntps的浓度，或者改变taq酶及其浓度等)，使得目的基因在扩增过程中引入一定量的突变，然后通过合适的高通量筛选方法获得具有目的表型的突变蛋白。在一些实施方案中，易错pcr的反应条件为：易错pcr体系(50μl)：5μl10×mutazymeii反应缓冲液1μl40mmdntp混合物(datp、dttp、dctp和dgtp各200μm终浓度)1μl上游引物cada-saci-f(10μm)1μl下游引物cada-xbal-r(10μm)1μlmutazymeiidna聚合酶(购自安捷伦科技(中国)有限公司)1μl模板dna(400ng)40μlddh2o至总体积为50μl。pcr程序：95摄氏度变性2min；95摄氏度变性30s，58摄氏度退火30s，72摄氏度延伸2min10s，28个循环；72摄氏度终延伸，7min。高通量筛选是指可以快速直观地从众多突变菌株中筛选出具有特定表型的突变菌株的方法，在本发明的一些实施方案中，采用抗生素和ph指示剂筛选的方法获得赖氨酸脱羧酶活性与对照菌株相比发生显著下降的菌株高通量筛选按如下步骤进行：a.大量抽提突变体文库中的重组赖氨酸脱羧酶突变基因的质粒，并重新转化至e.colibl21菌株中，同时转化pcib71质粒作为对照菌株，涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb抗性平板中进行筛选，随机挑取若干个单菌落于含有液体lb(+100μg/ml氨苄青霉素)的96孔深孔板中，37摄氏度，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号sph-200b)培养过夜(16h)。利用排枪各取600μl的lb培养液至一个新的96孔深孔板中(同时设置反应开始不加入，反应结束后加入对照菌液的反应孔作为空白对照)，加入400μl(浓度为400g/l)的赖氨酸盐酸盐溶液和辅酶plp(终浓度为0.1mm)，于37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号sph-200b)反应2hrs，根据赖氨酸脱羧酶催化过程中1,5-戊二胺的生成会伴随ph的升高，反应结束后于每个反应孔中滴加酸碱指示剂(指示剂b：1mg溴百里香酚蓝溶于10ml去离子水中；指示剂c：10mg中性红溶于10ml乙醇中；指示剂c和b按1：1混合)，根据指示剂颜色筛选明显没有对照ph升高的多(但相对空白对照仍有颜色变化)的突变株进行复筛。b.复筛的程序与初筛相同。在一些实施方案中，用于筛选赖氨酸脱羧酶突变体时所选的宿主细胞可以是微生物、植物或动物细胞，优选微生物细胞。在一些实施方案中，用于筛选赖氨酸脱羧酶突变体时选择作为宿主的微生物可以是大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、天蓝色链霉菌(s.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(h.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)，优选大肠杆菌和蜂房哈夫尼菌。在一些实施例中，用于筛选赖氨酸脱羧酶突变体的宿主菌是一株不含有内源性质粒的菌株，不含有内源性质粒可以是天然没有内源性质粒的菌株，也可以是通过技术手段筛选到的消除内源性质粒的菌株。在一些实施案例中，l-赖氨酸生产菌株为通过基因工程手段改造后可以生产l-赖氨酸的菌株，可供使用的赖氨酸生产菌株包括大肠杆菌(e.coli)和谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum)，在一些实施方案中，宿主菌优先选择为大肠杆菌(e.coli)。在一些实施方案中，l-赖氨酸生产菌株为适用于工业生产规模的工业菌株。工业菌株可以在放大实验中进行培养，包括摇瓶和发酵罐中进行培养，培养的规模可以足够大以进行工业化生产。在一些实施方案中，培养宿主细胞或l-赖氨酸生产菌株的温度可以是任何能够让其生长的温度，较合适的温度是20～40摄氏度，优选30～40摄氏度，更优选35～40摄氏度。培养的时间可以是约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天或者约10天。在一些实施方案中，培养宿主细胞的培养基含有肽、蛋白胨、维生素、微量元素和矿物质，这样的培养基包括但不局限于常用的lb培养基(由胰蛋白胨，酵母提取物和氯化钠溶解于水制成)。在一些实施方案中，重组l-赖氨酸生产菌株可以在含有碳源和非碳营养源的培养基中培养。碳源包含但不限于糖(碳水化合物，如葡萄糖和果糖等)。非碳营养源包括但不限于氮源，无机盐和其他有机营养源。例如，培养基包含转化子可吸收的碳源，还可以包含一种或一种以上的其他营养源，如氮源/无机盐和其他有机营养源。氮源可以包括氨，铵盐(如氯化铵，硫酸铵和磷酸铵)，蛋白胨，肉类提取物，酵母提取物等。无机盐包括但不限于磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钠等。其他有机营养源，包括但不限于氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和脯氨酸)等等。在一些实施方案中，培养基中l-赖氨酸和1,5-戊二胺的量可以通过核磁共振方法检测，细胞l-赖氨酸转化率采用核磁共振方法检测赖氨酸脱羧酶催化l-赖氨酸转化生成的1,5-戊二胺的量来计算。以下结合具体的实施案例对本发明做进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明而不能限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，在本发明范围内所做的任何变更，修改或直接采用实施例中的同等条件而实施的例子，都应理解为在本发明的涵盖范围内。以下实施例、对比例中提到的pcr扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。其中pcr扩增所用的dna聚合酶、酶切所用的限制性内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒、dna胶回收试剂盒、pcr纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司，商标axygen；引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，商标invitrogen；有特别说明的除外。如无特殊说明，以下实施例、对比例中提到的转化方法如下：将10μl的连接产物或2μl的质粒加入至100μl的大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，冰浴20min后在42℃中热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的lb培养基。涂布至相对应的抗性平板上。od600(od562nm)测量方法：将3ml的未培养细胞的培养基加入到1cm宽的比色皿中，在uv-8000紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)中600nm(562nm)下吸收光(abs)校零。将比色皿洗净晾干后加入2.9ml未培养细菌的培养基，加入0.1ml的发酵液混匀后在uv-8000紫外可见分光光度计中测试600nm(562nm)下的吸收光值。仪器显示数值乘以30即为发酵液的od600(od562nm)。实施例1赖氨酸脱羧酶基因cada的克隆使用引物cada-saci-f和cada-xbai-r(表1所示的引物)将赖氨酸脱羧酶(seqidno:1)编码基因cada(seqidno:2)从大肠杆菌mg1655k12(e.colimg1655k12，购自北京天恩泽生物技术有限公司)的基因组中扩增出来，通过saci和xbai双酶切后，连入同样双酶切的puc18质粒(购自宝生物工程(大连)有限公司)中。利用cacl2法制备感受态，并用热激法将连接产物转化至大肠杆菌e.colibl21(购自宝生物工程(大连)有限公司)细胞中，利用lb培养基中添加氨苄抗生素进行筛选，克隆pcr和测序验证正确(验证cada序列正确)后，抽提质粒即得到pcib60质粒。以质粒pcib60为模板，进一步利用引物cada-f2和cada-r2对pcib60质粒中cada基因的5’序列进行优化，使cada可以顺利表达，cada基因的5’端上游序列由5’-atttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaattcgagctc-3’(seqidno:56)替换为5’-atttcacacaggaaacagct-3’(seqidno:57)。pcr扩增后，利用dpni限制性内切酶对pcr产物进行消化，同样利用热激法转化至e.colibl21中，测序验证(验证5’端已优化)后得到质粒pcib71。表1.本发明中所用到的引物。实施例2赖氨酸脱羧酶基因cada易错pcr突变库的构建及其筛选利用实施例1中构建的质粒pcib71作为模板，利用引物cada-saci-f和cada-xbal-r以及genemorphiirandommutagenesiserror-pronepcr试剂盒(购自安捷伦科技(中国)有限公司)，按照该试剂盒的使用说明对cada基因进行随机突变并在基因两端引入酶切位点，使用该试剂盒能够保证a/t/c/g这四个碱基有相等的频率发生突变，并且仅仅需要通过改变反应中初始的靶标dna的量或者pcr的循环数来控制得到的pcr产物中平均每个基因发生点突变的个数。本实施例中通过使用较高的初始靶标dna的量(450ng)，较少的pcr循环次数(20次)，控制每个基因中有1-2个核苷酸发生突变，从而控制氨基酸突变频率为平均每个基因有1个氨基酸发生突变，这种突变频率对于研究蛋白结构与功能之间的关系较为理想。易错pcr体系(50μl)：5μl10×mutazymeii反应缓冲液1μl40mmdntp混合物(datp、dttp、dctp和dgtp各200μm终浓度)1μl上游引物cada-saci-f(10μm)1μl下游引物cada-xbal-r(10μm)1μlmutazymeiidna聚合酶1μl模板dna(400ng)40μlddh2o至总体积为50μl。pcr程序：95摄氏度变性2min；95摄氏度变性30s，58摄氏度退火30s，72摄氏度延伸2min10s，28个循环；72摄氏度终延伸，7min。1％(质量百分数)的琼脂糖凝胶检测pcr产物，并将目的大小(2.1～2.2kb)的条带切下来，利用dna凝胶回收试剂盒(购自康宁生命科学(吴江)有限公司，商标axygen)进行dna片段的回收。利用saci和xbai对回收的dna片段进行酶切，与同样双酶切的实施例中提到的pcib71进行连接。将连接产物转化至e.colidh5α(购自宝生物工程(大连)有限公司)中，构建赖氨酸脱羧酶基因的随机突变体库。大量抽提突变体文库中的重组赖氨酸脱羧酶突变基因的质粒，并重新转化至e.colibl21菌株中，同时转化pcib71质粒作为对照，涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的lb抗性平板中进行初筛，具体而言，随机挑取约2000个单菌落于含有液体lb(+100μg/ml氨苄青霉素)的96孔深孔板中，37摄氏度，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号sph-200b)培养过夜(16h)。利用排枪各取600μl的lb培养液至一个新的96孔深孔板中(同时设置反应开始不加入，反应结束后加入对照菌株的菌液的反应孔作为空白对照)，加入400μl(浓度为400g/l)的赖氨酸盐酸溶液和辅酶磷酸吡哆醛(plp，终浓度为0.1mm)，于37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号sph-200b)反应2hr，根据赖氨酸脱羧酶催化过程中1,5-戊二胺的生成会伴随ph的升高，反应结束后于每个反应孔中滴加酸碱指示剂(指示剂b：1mg溴百里香酚蓝溶于10ml去离子水中；指示剂c：10mg中性红溶于10ml乙醇中；指示剂c和b按1：1体积比混合)，根据指示剂颜色筛选明显没有对照ph升高的多(但仍有颜色变化)的突变株进行复筛和测序鉴定突变位点。实施例3赖氨酸脱羧酶cada易错pcr突变体文库筛选结果及突变位点测序鉴定对构建的cada易错pcr突变体文库进行初筛，2000个克隆中有31个在96孔深孔板中生长不起来的判定为假阳性克隆；其余1969个克隆中共筛选到19个克隆颜色变化明显弱于对照菌株的。对这19个克隆进行两次复筛(复筛方法与初筛同)。复筛后从中确定了4个克隆明显有低于对照pcib71的赖氨酸脱羧酶活性。进一步将这4个克隆接种至5mllb液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)进行培养，37摄氏度，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号sph-200b)过夜(16h)。抽提质粒后对赖氨酸脱羧酶基因进行测序鉴定突变位点，测序结果如下表2所示：表2：cada易错突变体文库中筛选到的4株突变体突变位点鉴定。突变体编号突变碱基及序列编号突变氨基酸及序列编号cada‐1a250g，t252a(seqidno:3)n84e(seqidno:4)cada‐2a250c，t252g(seqidno:5)n84q(seqidno:6)cada‐3g1048t，a1049g(seqidno:7)d470c(seqidno:8)cada‐4c990a(seqidno:9)d330e(seqidno:10)由上述表2中所列出的4株突变体的氨基酸测序结果可见，cada-1，cada-2和cada-3这三个突变体相比cada均发生了两个核苷酸的突变，而cada-4只发生了一个核苷酸的突变，符合在易错pcr设计时控制条件保证在pcr过程中只引入1-2个突变。由此共产生了三个突变cada蛋白，突变分别发生在cada的n84位点，d470位点和d330位点。利用predus软件(zhangqcetal.,nucleicacidsres.39,283-287,2011)对cada蛋白进行3d结构的预测，发现n84和d470位点都出现在cada单体的表面上，因此推测当不带电荷的天冬酰胺突变为带负电荷的谷氨酸(n84e)或r基团变长的谷氨酰胺(n84q)；或当带负电荷的天冬氨酸突变为不带电荷的半胱氨酸(d470c)时，都可能会严重影响cada蛋白和蛋白之间的相互作用，进一步影响cada蛋白多聚体的形成，因此使cada的活性出现了显著下降。另外，推测d330位点的突变(d330e)可能会影响到cada蛋白与辅酶磷酸吡哆醛(plp)的结合，其突变之后，cada突变蛋白可能会由于结合辅酶plp的能力减弱而导致其进行l-赖氨酸脱羧反应时活性发生显著下降。实施例4赖氨酸脱羧酶cada突变蛋白赖氨酸转化率测定将实施例3中提取的4个克隆的质粒和对照pcib71质粒分别转化至蜂房哈夫尼(蜂房哈夫尼菌cgmcc1.1009，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)的感受态细胞中，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb抗性平板中进行筛选。进一步分别挑取5个单克隆，利用5mllb液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)进行培养，37摄氏度，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号sph-200b)过夜(16h)。分别取600μl的各克隆的lb培养液至ep管中，并加入400μl(浓度为400g/l)的赖氨酸盐酸溶液和辅酶plp(终浓度为0.1mm)，自然ph(约为6.7)，于37摄氏度，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号sph-200b)反应2hrs，反应结束后对反应液进行12000rpm离心3min(常温离心机，型号beckmancoultermicrofuge16centrifuge，下同)，取500μl的反应液上清于核磁管中，并加入100μld2o：dmso＝30：1(质量比)作为内标，利用核磁共振(brukerultrashiedtm400plus,beckmannmr)检测反应体系中剩余的l-赖氨酸的量，以此计算生成的1,5-戊二胺的量和l-赖氨酸转化率(计算1,5-戊二胺的摩尔量除以剩余的赖氨酸和1,5-戊二胺的总摩尔量)，进而计算相对cib71的相对赖氨酸转化率，结果如表3所示。表3.核磁检测3株cada突变株与野生型菌株相比的l-赖氨酸转化率及od。如表3所示，相同的反应时间内，cada-1-n84e，cada-2-n84qcada-3-d470c和cada-4-d330e突变株的l-赖氨酸转化率分别是对照cib71菌株的72％，64％，46％和13％。而cada-1-n84e,cada-2-n84q和cada-4-d330e这三株突变株的生长od均比对照要高；突变株cada-3-d470c的od比对照稍微有所降低，但差异并不显著。由此可以分析导致这四株突变菌株的l-赖氨酸转化率低于对照菌株的原因并非因为突变菌株的生长变化，而是蛋白本身的突变造成的，还需要进一步分析是否因为突变蛋白的表达出现问题导致细胞的l-赖氨酸转化率较对照出现了下降。实施例5突变赖氨酸脱羧酶cada的提取及sds-page电泳分析利用实施例4中cib71、cada-1-n84e、cada-2-n84q和cada-4-d330e突变株的菌液，并根据实施例4中测定的菌株的od值将这几株菌的od调整为相同的水平，取同样体积(4ml)的同样od的野生型和突变株的菌液，12000rpm离心10min，弃上清。按如下步骤提取各菌株的胞内蛋白：1)用1ml的buffer1(buffer1(ph8):50mmtrishclph8；25mmnacl；2mmedta)重悬菌体(以下简称样品)。2)-20℃冻存1hr。3)37℃，15min融化样品。4)加5μl溶菌酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)，并继续在37摄氏度孵育3hr，期间颠倒混匀几次。5)-20℃冻存1hr。6)37℃，15min融化样品。7)加入1μl的dnasei(购自宝生物工程(大连)有限公司)，继续在37摄氏度孵育1hr。8)12000rpm离心10min，取上清至一个新的ep管中，确保上清不含有细胞碎片。9)上清保存在4℃冰箱备用。沉淀用1ml的buffer1悬浮，备用。分别取各菌株的胞内蛋白上清和沉淀各64μl，加入16μl的5×sds-page上样缓冲液(配方：250mmtris-hcl(ph6.8)，10％(w/v)sds,0.5％(w/v)溴酚蓝，50％(v/v)甘油，5％(v/v)β-巯基乙醇)于沸水浴中煮沸变性10min，短暂冷却后，12000rpm离心2min，取10μl上清进行sds-page分析，结果如图1所示。可以看出cada-1-n84e、cada-2-n84q和cada-4-d330e突变株上清中的赖氨酸脱羧酶cada表达量与对照cib71相比无下降，反而有增多的趋势；而沉淀中的赖氨酸脱羧酶和对照菌株相比cada-1-n84e无明显差异；cada-2-n84q和cada-4-d330e突变株与对照相比也有明显增加。由此可以推断导致cada-1-n84e、cada-2-n84q、cada-3-d470c和cada-4-d330e突变株表达的赖氨酸脱羧酶蛋白与对照相比l-赖氨酸转化率下降的原因是由于特定的氨基酸位点突变后对赖氨酸脱羧酶的结构产生了影响从而导致了赖氨酸脱羧酶的催化能力出现下降。实施例6不同浓度的1,5-戊二胺对微生物生长的抑制将能够表达赖氨酸脱羧酶cada的质粒pcib71转化至大肠杆菌cib103-2菌株中，得到cib103-71菌株。其中cib103-2菌株的具体构建方法如下：1.构建四环素外排泵(tetracyclineeffluxpump)表达载体骨架：利用引物psyn-1和psyn-2合成启动子序列(seqidno:11)，其中引物psyn-1包启动子序列和一段与puc18同源的序列，引物psyn-2包含一段与puc18同源的序列，这两个pcr引物用于扩增合成的启动子序列和puc18载体的一部分序列，其中包括多克隆位点，限制性内切酶ecori和scai用于消化扩增出来的dna片段，进一步连接入puc18中构建得到pcib10。2.构建四环素外排泵表达载体：利用引物teta-f和teta-r四环素外排泵teta(seqidno:12)编码基因(teta，seqidno:13)，从大肠杆菌克隆载体pbr322中扩增得到，利用saci和xbai双酶切后连接至pcib10质粒中得到pcib20。3.l-赖氨酸合成途径上三个蛋白lysc，dapa和lysa阅读框的构建：大肠杆菌基因组中编码l-赖氨酸生物合成途径上的三个蛋白的基因，lysc，dapa和lysa：天冬氨酸激酶(lysc或akiii，由lysc编码)，二氢吡啶二羧酸合酶(dapa或dhdps，由dapa编码)，二氨基庚酸脱羧酶(lysa，由lysa编码)，这三个基因克隆至质粒载体中，由此三个蛋白lysc(seqidno:14),dapa(seqidno:16),lysa(seqidno:18)可以实现在大肠杆菌中的过表达。首先利用引物lysc-f和lysc-r将基因lysc(seqidno:15)从大肠杆菌e.colimg1655k12的基因组中扩增出来，用saci和bamhi双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒puc18中得到质粒pcib7。利用引物dapa-f和dapa-r将基因dapa(seqidno:17)从大肠杆菌e.colimg1655k12的基因组中扩增出来，用bamhi和xbai双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pcib7中得到质粒pcib8。利用引物lysa-f和lysa-r将基因lysa(seqidno:19)从大肠杆菌e.colimg1655k12的基因组中扩增出来，用xbai和sali双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pcib8中得到质粒pcib9。再进一步利用lysc-f和lysa-r将这三个基因一并从pcib9中扩增出来，并利用saci和sali双酶切消化，连接至同样双酶切的质粒pcib10中得到pcib32。4.天冬氨酸激酶编码基因突变载体构建：为了提高l-赖氨酸的产量，进一步对天冬氨酸激酶基因(lysc或akiii，由lysc,seqidno:15编码)进行突变，具体而言，利用引物318-f,318-r,323-f,323-r扩增得到lysc-1(lysc-m318i,g323d，seq.idno:20)编码基因lysc-1(seqidno:21)，并通过替换pcib32中的野生型lysc，得到质粒pcib43。突变后的lysc-1能够进一步减弱l-赖氨酸的反馈抑制。5.构建l-赖氨酸合成通路中另外三种蛋白asd，dapb和aspc的共表达载体：进一步，对l-赖氨酸合成通路中的另外三个基因asd，dapb和aspc进行过表达。这些基因分别编码下列三个蛋白：天冬氨酸盐半醛脱氢酶(asd(seqidno:22，由asd编码)，二氢吡啶二羧酸还原酶(dapb或dhdpr(seqidno:24),由dapb编码)，天冬氨酸转氨酶(aspc(seqidno:26),由aspc编码)。利用引物asd-f和asd-r将asd(seqidno:23)从大肠杆菌mg1655k12基因组中扩增出来，利用saci和bamhi双酶切后，连接至puc18中构建得到pcib12；利用引物dapb-f和dapb-r将dapb(seqidno:25)从大肠杆菌mg1655k12基因组中扩增出来，利用bamhi和xbai双酶切后，连接至pcib12中构建得到pcib13；利用引物aspc-f和aspc-r将aspc(seqidno:27)从大肠杆菌mg1655k12基因组中扩增出来，利用xbai和sali双酶切后，连接至pcib13中构建得到pcib31；利用引物teta-f3和teta-r3，以质粒pcib20为模板，扩增得到teta编码基因，利用xhoi和sphi双酶切后连入pcib31构建得到pcib59。6.构建l-赖氨酸合成通路中六个基因共表达质粒：利用引物lal-fandlal-r从pcib43中将lysc-1,dapa,andlysa一起扩增出来，apai和kpni双酶切后，与同样双酶切的质粒pcib59连接，得到pcib103-2质粒。7.构建cib103-2菌株：将构建好的pcib103-2质粒转化至大肠杆菌bl21中，得到大肠杆菌cib103-2菌株。分别挑取cib103-71菌株的单克隆至含有不同浓度(0、5、10、15、20、25、30、35、40g/l)1,5-戊二胺的培养基(5ml液体培养基中含有4％<质量百分数，以下组分同>葡萄糖,0.1％kh2po4,0.1％mgso4,1.6％(nh4)2so4,0.001％feso4,0.001％mnso4,0.2％酵母提取物<购自英格兰oxoidltd.>,0.05％l-甲硫氨酸,0.01％l-苏氨酸,0.005％l-异亮氨酸,10μg/ml四环素)中，于37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号sph-200b)培养过夜(24h)，利用分光光度计测定各1,5-戊二胺浓度条件下菌体的od562nm。结果如图2所示，可以看出，当1,5-戊二胺浓度从0至10g/l逐渐增加时，菌体的od急剧下降；当1,5-戊二胺浓度超过20g/l后，几乎检测不到菌体生长。实施例7表达突变赖氨酸脱羧酶cada的赖氨酸生产菌株1,5-戊二胺产量的检测将随机突变筛选到的能够表达野生型赖氨酸脱羧酶cada和突变赖氨酸脱羧酶cada-1、cada-2、cada-3和cada-4的质粒分别转化至能够生产l-赖氨酸的大肠杆菌cib103-2中，分别得到cib103-71、cib103-72、cib103-73、cib103-74和cib103-75菌株。以cib103-2菌株作为对照，分别挑取三个单克隆至5ml液体培养基中(含有4％<质量百分数，以下组分同>葡萄糖,0.1％kh2po4,0.1％mgso4,1.6％(nh4)2so4,0.001％feso4,0.001％mnso4,0.2％酵母提取物<购自英格兰oxoidltd.>,0.05％l-甲硫氨酸,0.01％l-苏氨酸,0.005％l-异亮氨酸,10μg/ml四环素,100μg/ml氨苄西林)，于37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号sph-200b)培养过夜(24h)。第二天，每个菌株再分别转接至100ml新鲜的含有30g/l葡萄糖,0.7％(质量百分数)ca(hco3)2,10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄西林的培养基中于37℃，170rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，标准型大容量恒温培养摇床，型号sph-211b)继续培养72小时，利用核磁检测并计算各培养基中的l-赖氨酸和1,5-戊二胺的含量(表4)。如表4所示，随着突变株cib103-72、cib103-73、cib103-74表达的突变的赖氨酸脱羧酶cada-n84e，cada-n84q和cada-d470c的活性逐渐降低，1,5-戊二胺的产量逐渐升高，也就意味着更多的l-赖氨酸发生了转化，由此可能降低了l-赖氨酸对l-赖氨酸合成相关的酶的阻遏，l-赖氨酸的产量也会进一步增加并转化为戊二胺，体现在测定的l-赖氨酸和戊二胺的总量逐渐升高。但是当表达活性非常低的cada-d330e时，虽然在降低戊二胺对重组菌株cib103-75毒害作用方面有一些效果，表现在生成的戊二胺的量比cib103-71菌株有所增加，但是剩余了比较多的l-赖氨酸，这将意味着后续需要额外添加较多的赖氨酸脱羧酶将这些l-赖氨酸转化完。据此综合分析，能够表达突变赖氨酸脱羧酶cada-d470c的突变菌株cib103-74表现最好。表4.检测能同时表达赖氨酸合成蛋白及赖氨酸脱羧酶的菌株l-赖氨酸和1,5-戊二胺的水平。序列表<110>上海凯赛生物技术有限公司<120>赖氨酸脱羧酶突变体及其应用<130>lz1700069cn01<160>55<170>patentinversion3.3<210>1<211>715<212>prt<213>大肠杆菌<400>1metasnvalilealaileleuasnhismetglyvaltyrphelysglu151015gluproilearggluleuhisargalaleugluargleuasnphegln202530ilevaltyrproasnaspargaspaspleuleulysleuilegluasn354045asnalaargleucysglyvalilepheasptrpasplystyrasnleu505560gluleucysglugluileserlysmetasngluasnleuproleutyr65707580alaphealaasnthrtyrserthrleuaspvalserleuasnaspleu859095argleuglnileserphepheglutyralaleuglyalaalagluasp100105110ilealaasnlysilelysglnthrthraspglutyrileasnthrile115120125leuproproleuthrlysalaleuphelystyrvalarggluglylys130135140tyrthrphecysthrproglyhismetglyglythralapheglnlys145150155160serprovalglyserleuphetyraspphepheglyproasnthrmet165170175lysseraspileserileservalsergluleuglyserleuleuasp180185190hisserglyprohisl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