一种表观组学技术的制作方法

文档序号:11647324阅读:256来源:国知局

本发明涉及有机合成技术领域,尤其涉及一种表观组学技术。



背景技术:

表观遗传学是与遗传学(genetic)相对应的概念。遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化,如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等;而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,如dna甲基化和染色质构象变化等;表观基因组学(epigenomics)则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。随着表观组学的不断进步,从而对其的追求与探索从没间断过,而现有的表观组学技术对实验的精确度不足,极易容易出现误差,而影响实验数据,为此,我们提出了一种表观组学技术。



技术实现要素:

本发明提出了一种表观组学技术,以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明提出了一种表观组学技术,包括如下步骤:

s1、选取新鲜的样品,并将新鲜样品剪碎并浸没在含有甲醛交联缓冲液的离心管中,抽真空处理13-17min;

s2、向上述离心管中加入甘氨酸,混合均匀后,抽真空4-7min,取出样品,并洗涤3-6次,吸干样品表面水分,-80℃保存或继续操作;

s3、液氮研磨样品至粉末状,取与上述中相同量的样品与离心管中,加入抽提bufferi,冰上放置20-40min,期间可将样品摇匀,与抽提buffer充分反应;

s4、在冰上,用双层miracloth滤布过滤至新的离心管中,并在3-6℃的条件下,5500-6500rpm,离心15-25min,弃上清,并加入抽提bufferii,重新悬浮沉淀并转移到新的离心管中,3-6℃的条件下,11000-13000rpm,离心4-7min,弃上清,然后加入抽提bufferiii重新悬浮,并取一新的离心管加入等体积的抽提bufferiii,并将重新悬浮的溶液缓慢加入新的离心管的上层,3-6℃的条件下,14000-16000rpm,离心50-65min,弃上清,最后加入核酸裂解缓冲液,混匀,置冰上裂解20-40min;

s5、打断前,取每个样品于新的离心管中保存;

s6、用chip稀释缓冲液,洗涤proteinabeads,在离心管中加入chip稀释缓冲液和proteinbeads(加之前要充分混匀),并在静音混匀器上混匀4-7min,磁力架上静置1-3min,待上清澄清后弃上清;

s7、加入chip稀释缓冲液以及抗体,在3-6℃的条件下,静音混匀器上混匀4-12h后,在磁力架上放置3-6min,待上清澄清后弃上清,用chip稀释缓冲液清洗磁珠,再加入chip稀释缓冲液及离心好的染色质上清液,在3-6℃的条件下,静音混匀器上混匀7-12h;

s8、将上述处理后的样品(含有抗体-蛋白质-dna复合体)放置在磁力架上处理4-7min,弃上清,用washingbuffer在3-6℃的条件下,混匀洗涤3-6min,并放置在磁力架上静置2min,弃上清;

s9、加入elutionbuffer,在60-70℃的条件下,离心震荡15-25min后,在磁力架上放置2min吸上清于一新的离心管中,并做好标记,并加入nacl,在60-70℃的条件下,过夜解交联,并取input产物加入elutionbuffer和nacl同时解交联;

s10、在解交联后的产物中加入edta、rnase、tris-hcl与蛋白酶k,40-55℃的环境下处理50-65min,利用dna纯化试剂盒纯化的产物,加ddh2o,q-bit检测浓度及纯度,-80℃保存。

优选的,离心管在使用前,需经过多次消毒杀菌处理,并将其进行烘干处理。

优选的,在s5中所采用bioruptor非接触式超声波破碎仪进行超声打断,对打断后的样品可进行琼脂糖凝胶电泳检测。

优选的,最后对其进行dna平末端修复,链接测序接头,pcr产物扩增及片段选择,构建测序文库,上机测序。

本发明的有益效果:能够实现对不同样品进行转换,从而满足不同实验的需求,而且提高了实验的成功率与最终数据的准确度,有效促进表观组学的进步。

具体实施方式

下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。

实施例1

本发明提出了一种表观组学技术,包括如下步骤:

s1、选取新鲜的样品,并将新鲜样品剪碎并浸没在含有甲醛交联缓冲液的离心管中,抽真空处理13min;

s2、向上述离心管中加入甘氨酸,混合均匀后,抽真空4min,取出样品,并洗涤3次,吸干样品表面水分,-80℃保存或继续操作;

s3、液氮研磨样品至粉末状,取与上述中相同量的样品与离心管中,加入抽提bufferi,冰上放置20min,期间可将样品摇匀,与抽提buffer充分反应;

s4、在冰上,用双层miracloth滤布过滤至新的离心管中,并在3℃的条件下,5500rpm,离心15min,弃上清,并加入抽提bufferii,重新悬浮沉淀并转移到新的离心管中,3℃的条件下,11000rpm,离心4min,弃上清,然后加入抽提bufferiii重新悬浮,并取一新的离心管加入等体积的抽提bufferiii,并将重新悬浮的溶液缓慢加入新的离心管的上层,3℃的条件下,14000rpm,离心50min,弃上清,最后加入核酸裂解缓冲液,混匀,置冰上裂解20min;

s5、打断前,取每个样品于新的离心管中保存;

s6、用chip稀释缓冲液,洗涤proteinabeads,在离心管中加入chip稀释缓冲液和proteinbeads(加之前要充分混匀),并在静音混匀器上混匀4min,磁力架上静置1min,待上清澄清后弃上清;

s7、加入chip稀释缓冲液以及抗体,在3℃的条件下,静音混匀器上混匀4h后,在磁力架上放置3min,待上清澄清后弃上清,用chip稀释缓冲液清洗磁珠,再加入chip稀释缓冲液及离心好的染色质上清液,在3℃的条件下,静音混匀器上混匀7h;

s8、将上述处理后的样品(含有抗体-蛋白质-dna复合体)放置在磁力架上处理4min,弃上清,用washingbuffer在3℃的条件下,混匀洗涤3min,并放置在磁力架上静置2min,弃上清;

s9、加入elutionbuffer,在60℃的条件下,离心震荡15min后,在磁力架上放置2min吸上清于一新的离心管中,并做好标记,并加入nacl,在60℃的条件下,过夜解交联,并取input产物加入elutionbuffer和nacl同时解交联;

s10、在解交联后的产物中加入edta、rnase、tris-hcl与蛋白酶k,40℃的环境下处理50min,利用dna纯化试剂盒纯化的产物,加ddh2o,q-bit检测浓度及纯度,-80℃保存。

离心管在使用前,需经过多次消毒杀菌处理,并将其进行烘干处理。

在s5中所采用bioruptor非接触式超声波破碎仪进行超声打断,对打断后的样品可进行琼脂糖凝胶电泳检测。

最后对其进行dna平末端修复,链接测序接头,pcr产物扩增及片段选择,构建测序文库,上机测序。

实施例2

本发明提出了一种表观组学技术,包括如下步骤:

s1、选取新鲜的样品,并将新鲜样品剪碎并浸没在含有甲醛交联缓冲液的离心管中,抽真空处理14min;

s2、向上述离心管中加入甘氨酸,混合均匀后,抽真空4-7min,取出样品,并洗涤4次,吸干样品表面水分,-80℃保存或继续操作;

s3、液氮研磨样品至粉末状,取与上述中相同量的样品与离心管中,加入抽提bufferi,冰上放置25min,期间可将样品摇匀,与抽提buffer充分反应;

s4、在冰上,用双层miracloth滤布过滤至新的离心管中,并在4℃的条件下,5600rpm,离心18min,弃上清,并加入抽提bufferii,重新悬浮沉淀并转移到新的离心管中,4℃的条件下,11500rpm,离心5min,弃上清,然后加入抽提bufferiii重新悬浮,并取一新的离心管加入等体积的抽提bufferiii,并将重新悬浮的溶液缓慢加入新的离心管的上层,4℃的条件下,14500rpm,离心5min,弃上清,最后加入核酸裂解缓冲液,混匀,置冰上裂解255min;

s5、打断前,取每个样品于新的离心管中保存;

s6、用chip稀释缓冲液,洗涤proteinabeads,在离心管中加入chip稀释缓冲液和proteinbeads(加之前要充分混匀),并在静音混匀器上混匀5min,磁力架上静置1.5min,待上清澄清后弃上清;

s7、加入chip稀释缓冲液以及抗体,在4℃的条件下,静音混匀器上混匀4-12h后,在磁力架上放置4min,待上清澄清后弃上清,用chip稀释缓冲液清洗磁珠,再加入chip稀释缓冲液及离心好的染色质上清液,在4℃的条件下,静音混匀器上混匀8h;

s8、将上述处理后的样品(含有抗体-蛋白质-dna复合体)放置在磁力架上处理5min,弃上清,用washingbuffer在4℃的条件下,混匀洗涤4min,并放置在磁力架上静置2min,弃上清;

s9、加入elutionbuffer,在63℃的条件下,离心震荡18min后,在磁力架上放置2min吸上清于一新的离心管中,并做好标记,并加入nacl,在63℃的条件下,过夜解交联,并取input产物加入elutionbuffer和nacl同时解交联;

s10、在解交联后的产物中加入edta、rnase、tris-hcl与蛋白酶k,45℃的环境下处理55min,利用dna纯化试剂盒纯化的产物,加ddh2o,q-bit检测浓度及纯度,-80℃保存。

离心管在使用前,需经过多次消毒杀菌处理,并将其进行烘干处理。

在s5中所采用bioruptor非接触式超声波破碎仪进行超声打断,对打断后的样品可进行琼脂糖凝胶电泳检测。

最后对其进行dna平末端修复,链接测序接头,pcr产物扩增及片段选择,构建测序文库,上机测序。

实施例3

本发明提出了一种表观组学技术,包括如下步骤:

s1、选取新鲜的样品,并将新鲜样品剪碎并浸没在含有甲醛交联缓冲液的离心管中,抽真空处理16min;

s2、向上述离心管中加入甘氨酸,混合均匀后,抽真空6min,取出样品,并洗涤5次,吸干样品表面水分,-80℃保存或继续操作;

s3、液氮研磨样品至粉末状,取与上述中相同量的样品与离心管中,加入抽提bufferi,冰上放置35min,期间可将样品摇匀,与抽提buffer充分反应;

s4、在冰上,用双层miracloth滤布过滤至新的离心管中,并在5℃的条件下,6200rpm,离心22min,弃上清,并加入抽提bufferii,重新悬浮沉淀并转移到新的离心管中,5℃的条件下,12200rpm,离心6min,弃上清,然后加入抽提bufferiii重新悬浮,并取一新的离心管加入等体积的抽提bufferiii,并将重新悬浮的溶液缓慢加入新的离心管的上层,5℃的条件下,15200rpm,离心60min,弃上清,最后加入核酸裂解缓冲液,混匀,置冰上裂解35min;

s5、打断前,取每个样品于新的离心管中保存;

s6、用chip稀释缓冲液,洗涤proteinabeads,在离心管中加入chip稀释缓冲液和proteinbeads(加之前要充分混匀),并在静音混匀器上混匀6min,磁力架上静置2min,待上清澄清后弃上清;

s7、加入chip稀释缓冲液以及抗体,在5℃的条件下,静音混匀器上混匀8h后,在磁力架上放置5min,待上清澄清后弃上清,用chip稀释缓冲液清洗磁珠,再加入chip稀释缓冲液及离心好的染色质上清液,在5℃的条件下,静音混匀器上混匀8h;

s8、将上述处理后的样品(含有抗体-蛋白质-dna复合体)放置在磁力架上处理6min,弃上清,用washingbuffer在5℃的条件下,混匀洗涤5min,并放置在磁力架上静置2min,弃上清;

s9、加入elutionbuffer,在67℃的条件下,离心震荡22min后,在磁力架上放置2min吸上清于一新的离心管中,并做好标记,并加入nacl,在67℃的条件下,过夜解交联,并取input产物加入elutionbuffer和nacl同时解交联;

s10、在解交联后的产物中加入edta、rnase、tris-hcl与蛋白酶k,50℃的环境下处理60min,利用dna纯化试剂盒纯化的产物,加ddh2o,q-bit检测浓度及纯度,-80℃保存。

离心管在使用前,需经过多次消毒杀菌处理,并将其进行烘干处理。

在s5中所采用bioruptor非接触式超声波破碎仪进行超声打断,对打断后的样品可进行琼脂糖凝胶电泳检测。

最后对其进行dna平末端修复,链接测序接头,pcr产物扩增及片段选择,构建测序文库,上机测序。

实施例4

本发明提出了一种表观组学技术,包括如下步骤:

s1、选取新鲜的样品,并将新鲜样品剪碎并浸没在含有甲醛交联缓冲液的离心管中,抽真空处理17min;

s2、向上述离心管中加入甘氨酸,混合均匀后,抽真空7min,取出样品,并洗涤6次,吸干样品表面水分,-80℃保存或继续操作;

s3、液氮研磨样品至粉末状,取与上述中相同量的样品与离心管中,加入抽提bufferi,冰上放置40min,期间可将样品摇匀,与抽提buffer充分反应;

s4、在冰上,用双层miracloth滤布过滤至新的离心管中,并在6℃的条件下,6500rpm,离心25min,弃上清,并加入抽提bufferii,重新悬浮沉淀并转移到新的离心管中,6℃的条件下,13000rpm,离心4-7min,弃上清,然后加入抽提bufferiii重新悬浮,并取一新的离心管加入等体积的抽提bufferiii,并将重新悬浮的溶液缓慢加入新的离心管的上层,6℃的条件下,16000rpm,离心65min,弃上清,最后加入核酸裂解缓冲液,混匀,置冰上裂解40min;

s5、打断前,取每个样品于新的离心管中保存;

s6、用chip稀释缓冲液,洗涤proteinabeads,在离心管中加入chip稀释缓冲液和proteinbeads(加之前要充分混匀),并在静音混匀器上混匀7min,磁力架上静置3min,待上清澄清后弃上清;

s7、加入chip稀释缓冲液以及抗体,在6℃的条件下,静音混匀器上混匀12h后,在磁力架上放置6min,待上清澄清后弃上清,用chip稀释缓冲液清洗磁珠,再加入chip稀释缓冲液及离心好的染色质上清液,在6℃的条件下,静音混匀器上混匀12h;

s8、将上述处理后的样品(含有抗体-蛋白质-dna复合体)放置在磁力架上处理7min,弃上清,用washingbuffer在6℃的条件下,混匀洗涤6min,并放置在磁力架上静置2min,弃上清;

s9、加入elutionbuffer,在70℃的条件下,离心震荡25min后,在磁力架上放置2min吸上清于一新的离心管中,并做好标记,并加入nacl,在70℃的条件下,过夜解交联,并取input产物加入elutionbuffer和nacl同时解交联;

s10、在解交联后的产物中加入edta、rnase、tris-hcl与蛋白酶k,55℃的环境下处理65min,利用dna纯化试剂盒纯化的产物,加ddh2o,q-bit检测浓度及纯度,-80℃保存。

离心管在使用前,需经过多次消毒杀菌处理,并将其进行烘干处理。

在s5中所采用bioruptor非接触式超声波破碎仪进行超声打断,对打断后的样品可进行琼脂糖凝胶电泳检测。

最后对其进行dna平末端修复,链接测序接头,pcr产物扩增及片段选择,构建测序文库,上机测序。

以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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