本发明属于生物工程技术领域，涉及一种半连续发酵生产丙酸联产维生素b12的装置及方法，尤其涉及膜分离技术和层析技术耦合发酵联产维生素b12和丙酸的工艺。
背景技术：
费氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudenreichii)是美国fda和美国饲料控制官员协会(aafco)批准使用的饲用微生物菌种，也是厌氧法发酵生产维生素b12的生产菌株。维生素b12厌氧发酵工艺的动力消耗低，一直被大多数生产企业采用。但是，近年来随着脱氮假单孢菌(pscudomonasdenitrificans)好氧发酵维生素b12的水平逐步提高，厌氧发酵工艺的优势已经无法突显。因此，提高费氏丙酸杆菌厌氧发酵维生素b12的效率，具有重要的经济价值和应用前景。
费氏丙酸杆菌发酵生产维生素b12的同时，会产生以丙酸为主的胞外代谢产物，而发酵液中丙酸的不断积累会对菌体细胞生长及丙酸自身代谢产生反馈抑制作用。为了解除丙酸对发酵的反馈抑制作用，研究人员对生产菌株进行了基因改造(biotechnologyandbioengineering,2009,104:766-773；metabolicengineering,2015,27:46-56)，研究了丙酸的反馈抑制机理(journalofbiotechnology,2013,167:56-63)，并采取适当的调控策略(bioresourcetechnology,2012,105:128-133；bioresourcetechnology,2013,135:504-512)来提高批次发酵过程中丙酸的产量。此外，研究还发现，在发酵过程中采用过程工程手段及时移除丙酸，可有效效减缓或消除其对发酵的反馈抑制作用，提高发酵效率。“appliedmicrobiologyandbiotechnology,2001,56:676-680”报道了goswami构建了一种原位细胞截留反应器，通过不锈钢旋转过滤器将菌体细胞截留，使含高浓度丙酸的发酵清液滤过，从而实现了菌体细胞与丙酸的分离。“journalofbiotechnology,2012,164:202-210”报道了，南京工业大学欧阳平凯院士构建了一种多孔纤维床反应器将发酵过程中产生的丙酸及时分离出来，提高了发酵产率。“bioresourcetechnology,2012,112:248-253”报道了，浙江大学徐志南教授通过将菌体细胞固定化在纤维床反应器上，采用流加葡萄糖的方式，提高了发酵效率。“bioresourcetechnology,2012,104：652-659”报道了，中科院过程所王云山研究员将扩张床层析技术与发酵过程耦合起来，建立了一种以扩张床原位吸附为特征的新型发酵过程，提高了维生素b12的产量。但是，在工业生产过程中，上述工艺普遍面临着难以放大、成本高等问题。
为了进一步提高发酵效率和底物转化率，降低发酵成本，中科院过程所王云山研究员提出，应该将丙酸从副产物的角色转变成目标产物，在扩张床耦合发酵的基础上，实现维生素b12和丙酸的联产，达到“一菌两用”的目标。“appliedmicrobiologyandbiotechnology,2014,98:7761-7772”研究发现，费氏丙酸杆菌代谢合成丙酸与emp途径和wood-werkmman途径密切相关。从丙酸发酵和维生素b12的代谢途径可以看出，coa转移酶可以将丙酰coa上的辅酶转移至琥珀酸上，从而生成丙酸和琥珀酰coa，而琥珀酰coa和甘氨酸缩合反应后可生成维生素b12合成的关键代谢中间体5-氨基乙酰丙酸，然后再经过聚合、重排、环化、甲基化、去碳酸基、钴离子插入以及环缩作用等生成维生素b12。因此，从这个角度讲，维生素b12和丙酸的合成代谢是相辅相成的，具备了维生素b12和丙酸双产物联产的理论基础。
费氏丙酸杆菌的胞内代谢产物腺苷钴啉醇酰胺(ado-cbi)是维生素b12的一个关键代谢中间体，其磷酸化后可与α-吡咯核糖反应生成维生素b12。但是，由于胞内的α-吡咯核糖浓度较低，限制了ado-cbi的转化速率，并使其在胞内不断积累，因此，α-吡咯核糖是该反应的一个关键限速因子。生产过程中常通过人为添加其结构类似物5,6-二甲基苯并咪唑(dmb)来促进维生素b12的合成。
不足之处就是，dmb的添加会影响维生素b12代谢中间体的合成，不利于费氏丙酸杆菌的连续发酵，因此，为了实现维生素b12和丙酸的双产物联产，“中国生物工程杂志，2016,36(4):104-109；过程工程学报，2016,16(2):298-302”中科院过程所王云山研究员提出了“细胞离位转化”的概念，不仅避免了前体物质dmb对发酵的影响，还有助于在分批补料发酵的基础上实现半连续发酵生产。即当发酵进行到某个时间节点时，采用适合的方法(离心或膜分离)将菌体细胞从发酵液中分离出来，转移至另一个反应体系中，加入dmb进行维生素b12的后期合成，而原有发酵体系继续运行。
cn101402913a公开了一种批式发酵法生产丙酸联产维生素b12的装置，包括丙酸固定化生产单元和维生素b12的生产单元，两个生产单元通过恒流泵相连接。所述丙酸发酵中，采用甘蔗渣的织物纤维固定化柱将丙酸杆菌进行固定，后续容易将丙酸杆菌和丙酸发酵液分离，但是固定化丙酸杆菌是一个周期长，难度大的步骤，其需要耗费大量的时间，且容易固定失败。
技术实现要素：
针对现有技术存在的工业化放大生产难、扩张床填充率低、丙酸杆菌不易与丙酸发酵液分离等问题，本发明的目的在于提供一种半连续发酵生产丙酸联产维生素b12的装置及方法，所述方法在膜分离细胞的基础上，耦合固定床层析技术，吸附分离发酵液中的丙酸，解除了丙酸对发酵的反馈抑制作用，并采用再次接种的方法，在分批补料发酵的基础上，实现了维生素b12和丙酸的半连续发酵联产，提高了发酵效率和底物转化率，降低了发酵成本。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明的提供了一种半连续发酵生产丙酸联产维生素b12的装置，所述装置包括发酵单元、膜分离单元、丙酸分离单元和维生素b12的转化单元，所述发酵单元的出料口通过膜分离单元与丙酸分离单元和维生素b12的转化单元的进料口相连接，所述丙酸分离单元的出料口与发酵单元的回流口相连接；
所述膜分离单元包括膜分离设备21，所述膜分离设备21包括膜芯，所述膜芯的孔径为0.1-0.22μm。
本发明中，所述转置通过膜分离设备将发酵液进行分离，而通过选择膜芯的孔径大小，将发酵液中的费氏丙酸杆菌细胞截留浓缩，将含有丙酸的发酵清液分离，不仅不需要将费氏丙酸杆菌进行固定就可以达到分离细胞和发酵清液的目的，还通过分流，将细胞和发酵清液进入两个不同的循环，解除了丙酸对发酵的反馈抑制作用，同时将细胞进行维生素b12的转化生产，而丙酸分离后的废液又可以回流如发酵单元中，进行循环发酵。
优选地，所述膜芯的孔径为0.1-0.22μm，例如可以是0.1μm或0.22μm，优选为0.22μm。
优选地，所述膜芯为聚醚砜类卷式有机膜、聚醚砜类卷式平板膜或氧化锆类管式陶瓷膜中的任意一种，优选为聚醚砜类卷式有机膜。
优选地，所述膜芯的膜面积为不小于0.12m2，例如可以是0.12m2、0.25m2、0.5m2、1m2、1.2m2、1.5m2、1.8m2、2m2、2.2m2、2.5m2、2.8m2、3m2、3.2m2、3.5m2、4m2、4.5m2、5m2、5.5m2、6m2、7m2、8m2、9m2或10m2，优选为0.12-3m2。
优选地，所述发酵单元包括发酵罐11，所述发酵罐11的罐体的上半部设置有发酵罐进料口12，所述发酵罐11的罐顶设置有搅拌装置13。
本发明中，所述发酵罐的体积本领域技术人员可以根据需要进行选择，在此不做特殊限定，本发明优选体积为10l的发酵罐，料液装填系数为0.7.
本发明中，所述进料口12用于料液的补充及营养物质的添加。
优选地，所述丙酸分离单元包括与膜分离单元相连的层析柱31，所述层析柱31的出料口与发酵罐11的回流口相连。
本发明中，所述层析柱的出料口与与发酵罐11的回流口相连为了将层析柱吸附后的废液回流入发酵罐中进行再次发酵生产。
优选地，所述层析柱31中的填充材料为阴离子交换树脂，优选为zgd630阴离子交换树脂。
优选地，所述层析柱31的数量为1-8，例如可以是1、2、3、4、5、6、7或8，优选为2-6，进一步优选为3。
本发明中所述层析柱多于1个时，采用并联的方式将多个层析柱相连接。
本发明中所述层析柱中的阴离子交换树脂zgd630在吸附完丙酸后经过洗脱装置的洗脱后得到丙酸。
优选地，所述维生素b12的转化单元包括与膜分离单元相连的转化反应器41，所述转化反应器41的上半部设置有转化反应器进料口12。
所述半连续发酵生产丙酸联产维生素b12的装置的工作过程如下：
在发酵培养基中接种费氏丙酸杆菌进行发酵培养，将膜分离装置中的各管道清洗干净，装入待用的膜芯，然后用0.5％w/w的亚硫酸氢钠进行清洗，使其在系统中循环40-60min；当发酵进行至84h时，然后开机运行，并调整膜设备的压力及流量，使发酵液从出料口中流出进入膜分离单元，在膜分离装置中循环，随着含丙酸等有机酸组分的滤液不断渗出，原有的发酵液逐步得到浓缩，并使得菌体细胞与发酵清液分离开来，实现了菌体细胞的在线分离；分离的发酵清液从膜分离转置中进入丙酸分离单元的层析柱中进行丙酸分离，随着zgd630树脂对滤过清液中的丙酸等有机酸的不断吸附，使得滤液中的有机酸浓度逐渐降低，当丙酸浓度低至10g/l时，停止吸附，从层析柱中流出的废液回流至发酵单元的发酵罐中补入营养物质和费氏丙酸杆菌进行再次发酵，将层析柱中的zgd630树脂进行洗脱，可得到丙酸；而分离的菌体细胞进入维生素b12的转化单元，进入dmb进行维生素b12的转化生产。
另一方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的装置发酵生产丙酸联产维生素b12的方法，包括如下步骤：
(1)在发酵培养基中接种费氏丙酸杆菌进行发酵培养；
(2)将步骤(1)发酵培养后的培养液通过膜分离装置分离，得到发酵清液和浓缩的菌体细胞；
(3)将步骤(2)处理后的发酵清液通过层析柱进行丙酸分离；
(4)将步骤(3)丙酸分离后的废液回流入发酵罐中，补加营养物质后，接入费氏丙酸杆菌，继续发酵；
(5)将步骤(2)处理后的菌体细胞转移至转化反应器中，进行维生素b12的转化生产。
优选地，步骤(1)所述的接种费氏丙酸杆菌为将保存的费氏丙酸杆菌接种到种子培养基中一次活化，再将活化后的费氏丙酸杆菌接种到二级摇瓶种子培养基中二次活化，将二次活化后的费氏丙酸杆菌接种到发酵培养基中发酵培养。
本发明中的费氏丙酸杆菌为本领域可购买得到的费氏丙酸杆菌，本领域技术人员可以根据需要自行购买，本发明中的费氏丙酸杆菌购买于微生物保藏中心，并没有经过任何的驯化，而不同购买地的费氏丙酸杆菌及不同批次的费氏丙酸杆菌对丙酸和维生素b12的转化生产率都不尽相同，而本发明都采用同样购买地同一批次的费氏丙酸杆菌进行试验，而不同购买地和不同批次的费氏丙酸杆菌对本发明的方法不构成影响。
优选地，所述种子培养基为：葡萄糖35g/l，玉米浆21g/l，硫酸铵5g/l，磷酸二氢钾4g/l，氯化钴0.005g/l，ph6.8-7.0。
本发明中通过流加高浓度葡萄糖(50wt％)的方式，使得葡萄糖的浓度不低于10g/l，利于发酵的进行和丙酸的产生。
优选地，所述活化的温度为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为28-32℃，优选为30℃。
优选地，所述一次活化和二次活化的时间独立地为40-80h，例如可以是40h、41h、42h、43h、45h、46h、48h、50h、51h、52h、53h、54h、55h、56h、58h、60h、62h、63h、65h、68h、70h、72h、75h、76h、78h或80h，优选为45-55h，进一步优选为48h。
优选地，步骤(1)发酵培养的碳源为葡萄糖、甘油，优选为葡萄糖。
优选地，步骤(1)所述的发酵培养基为：葡萄糖60g/l，玉米浆41g/l，磷酸二氢钾4.6g/l，氯化钴0.0127g/l，ph6.8-7.0。
优选地，步骤(1)所述发酵培养的温度为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃。
优选地，步骤(1)发酵培养的搅拌速率为30-100r/min，例如可以是30r/min、40r/min、50r/min、60r/min、70r/min、80r/min、90r/min、100r/min，优选为40-80r/min，进一步优选为50r/min。
优选地，步骤(1)发酵培养的ph为6-8，例如可以是6、6.1、6.3、6.5、6.8、7、7.1、7.3、7.5、7.8、8，优选为6.8-7.2。
优选地，步骤(1)所述发酵的时间为80-90h，例如可以80h、81h、82h、83h、84h、85h、86h、87h、88h、89h或90h，优选为82-85h，进一步优选为84h。
优选地，所述膜分离装置中的膜芯为聚醚砜类卷式有机膜、聚醚砜类卷式平板膜或氧化锆类管式陶瓷膜中的任意一种，优选为聚醚砜类卷式有机膜。
优选地，所述膜分离装置中的膜芯的孔径为0.1-0.22μm，例如可以是0.1μm或0.22μm，优选为0.22μm。
优选地，所述膜芯的膜面积为不小于0.12m2，例如可以是0.12m2、0.25m2、0.5m2、1m2、1.2m2、1.5m2、1.8m2、2m2、2.2m2、2.5m2、2.8m2、3m2、3.2m2、3.5m2、4m2、4.5m2、5m2、5.5m2、6m2、7m2、8m2、9m2或10m2，优选为0.12-3m2。
优选地，所述膜分离装置运行前进行清洗，所述清洗液为亚硫酸氢钠。
优选地，所述亚硫酸氢钠的质量分数为0.1-2％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％或2％，优选为0.3-0.8％。
优选地，所述清洗的时间为30-80min，例如可以是30min、31min、32min、33min、35min、36min、38min、40min、42min、45min、48min、50min、52min、55min、58min、60min、62min、65min、68min、70min、72min、75min、78min或80min，优选为40-60min。
本发明中，所述膜分离装置的压力和流量本领域技术人员可以根据需要进行调节，在此不做特殊限定，本发明所述装置的压力为10bar，流量为8lpm。
优选地，步骤(2)所述分离的温度为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃。
优选地，步骤(2)所述分离的时间为30-80min，例如可以是30min、31min、32min、33min、35min、36min、38min、40min、42min、45min、48min、50min、52min、55min、58min、60min、62min、65min、68min、70min、72min、75min、78min或80min，优选为40-60min。
优选地，所述浓缩的菌体细胞的浓缩过程需要控制在2-3h，即膜的平均通量为2.5-3.5l/h，所述浓缩倍数为2-4倍，例如可以是2倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍，优选为4倍。
优选地，步骤(3)所述层析柱中的填充材料为阴离子交换树脂，优选为zgd630阴离子交换树脂。
优选地，所述阴离子交换树脂zgd630的装填量相对于7l的发酵液时，为不小于2.5l，例如可以是2.5l、3l、3.5l、4l、4.5l、5l、5.5l、6l、6.5l、7l、7.5l、8l、8.5l、9l、9.5l或10l，优选为2.5-5l。
本发明中，阴离子交换树脂zgd630对丙酸吸附量为44.1mg/g(ph6.80)，将发酵液中的丙酸从30g/l降至10g/l，树脂需量为大于等于2500l，所以本发明中阴离子交换树脂zgd630的装填量是根据7l的发酵液来限定的，本领域技术人员可以根据发酵液的体积来调节阴离子交换树脂zgd630的装填量。
优选地，步骤(3)所述层析柱的上样速度为1-4bv/h，例如可以是1bv/h、1.2bv/h、1.3bv/h、1.5bv/h、1.6bv/h、1.8bv/h、2bv/h、2.1bv/h、2.3bv/h、2.5bv/h、2.6bv/h、2.8bv/h、3bv/h、3.1bv/h、3.3bv/h、3.5bv/h、3.8bv/h或4bv/h，优选的是3bv/h。
优选地，所述阴离子交换树脂zgd630在吸附完丙酸后经过洗脱得到丙酸；
优选地，步骤(4)回流的废液的丙酸浓度低于10g/l，例如可以是1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l，优选为3-8g/l。
优选地，步骤(4)所述的营养物质为葡萄糖和玉米浆。
优选地，步骤(4)所述费氏丙酸杆菌的接种量为8-12％，例如可以是8％、9％、10％、11％或12％，优选为10％。
优选地，步骤(5)所述进行维生素b12的转化生产前补加前体物质5,6二甲基苯并咪唑(dmb)。
本发明中，所述dmb的添加量可参照其他批次发酵时dmb的用量，本领域技术人员可以根据需要进行选择，本发明中，当菌体细胞的浓缩4倍时，dmb的添加量为3.6mg/l。
优选地，步骤(5)所述的转化的温度为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃。
优选地，步骤(5)所述的转化的时间为65-80h，例如可以是65h、66h、67h、68h、69h、70h、71h、72h、73h、74h、75h、76h、77h、78h、79h或80h，优选为70-75h。
优选地，步骤(5)所述的转化的ph为6-7.5，例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5，优选为6.5-7.3，优选为6.8-7.2。
本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
作为优选技术方案，所述方法包括如下步骤：
(1)将保存的费氏丙酸杆菌接种到种子培养基中在温度25-35℃一次活化40-80h，再将活化后的费氏丙酸杆菌接种到二级摇瓶种子培养基中在温度25-35℃二次活化40-80h，将二次活化后的费氏丙酸杆菌接种到发酵培养基中在温度25-35℃、搅拌速率30-100r/min、ph6-8下厌氧发酵培养80-90h；
(2)采用质量分数为0.1-2％的亚硫酸氢钠清洗孔径为0.1-0.22μm、膜面积为不小于0.12m2的聚醚砜类卷式有机膜的膜分离装置30-80min，将步骤(1)发酵培养后的培养液通过膜分离装置在温度25-35℃分离30-80min，得到发酵清液和浓缩倍数为2-4倍的菌体细胞；
(3)将步骤(2)处理后的发酵清液通过阴离子交换树脂zgd630层析柱，上样速度为1-4bv/h进行丙酸分离，所述阴离子交换树脂zgd630在吸附完丙酸后经过洗脱得到丙酸，其中，所述阴离子交换树脂zgd630的装填量相对于7l的发酵液为不小于2.5l；
(4)当步骤(3)丙酸分离后得到的丙酸浓度低于10g/l的废液回流入发酵罐中，补加葡萄糖、玉米浆等营养物质后，接入接种量为10％的费氏丙酸杆菌，继续发酵；
(5)将步骤(2)处理后的菌体细胞转移至转化反应器中，补加前体物质5,6二甲基苯并咪唑(dmb)，在温度25-35℃、ph为6-7.5进行维生素b12的转化，转化时间为65-80h，收集菌体，进行维生素b12的提取纯化。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的费氏丙酸杆菌半连续发酵工艺，通过模块化单元操作和过程集成，采用再次接种的方法，完成半连续发酵，实现了维生素b12和丙酸的联产，丙酸的生产率可达0.332g/(l·h)，维生素b12生产率可达0.149mg/(l·h)，提高了发酵效率和底物转化率，丙酸的转化率相比于批次发酵提高了33.98％，维生素b12转化率相比于批次发酵提高了44.56％；
(2)本发明方法在膜分离细胞的基础上，耦合固定床层析技术，吸附分离发酵液中的丙酸，不仅有效解决了丙酸对发酵的反馈抑制作用，还克服了扩张床填充效率低，难以放大的劣势，而且也解决了菌体细胞固定时间长，固定难度大的问题；
(3)本发明有效解决了dmb添加对发酵废水资源化利用的不利影响，实现了发酵废液的循环利用。
附图说明
图1为本发明半连续发酵生产丙酸联产维生素b12的装置结构示意图，其中，11-发酵罐，22-发酵罐进料口，13-搅拌装置，21-膜分离装置，31-层析柱，41-转化反应器进料口，42-转化反应器。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
一种半连续发酵生产丙酸联产维生素b12的装置，如图1所示，所述装置包括发酵单元、膜分离单元、丙酸分离单元和维生素b12的转化单元，所述发酵单元的出料口通过膜分离单元与丙酸分离单元和维生素b12的转化单元的进料口相连接，所述丙酸分离单元的出料口与发酵单元的回流口相连接；
所述发酵单元包括发酵罐11，所述发酵罐11的罐体的上半部设置有发酵罐进料口12，所述发酵罐11的罐顶设置有搅拌装置13，所述进料口12用于料液的补充及营养物质的添加；
所述丙酸分离单元包括与膜分离单元相连的层析柱31，所述层析柱31的出料口与发酵罐11的回流口相连，所述层析柱的出料口与与发酵罐11的回流口相连为了将层析柱吸附后的废液回流入发酵罐中进行再次发酵生产；
所述维生素b12的转化单元包括与膜分离单元相连的转化反应器41，所述转化反应器41的上半部设置有转化反应器进料口12；
所述膜分离单元包括膜分离设备21，所述膜分离设备21包括膜芯，所述膜芯的孔径为0.1-0.22μm；
所述膜芯为聚醚砜类卷式有机膜，所述膜芯的膜面积为不小于0.12m2；
所述层析柱31中的填充材料为阴离子交换树脂zgd630，所述层析柱31的数量为3，3个层析柱并联。
所述装置的工作过程如下：
在发酵培养基中接种费氏丙酸杆菌进行发酵培养，将膜分离装置中的各管道清洗干净，装入待用的膜芯，然后用0.5％w/w的亚硫酸氢钠进行清洗，使其在系统中循环40-60min；当发酵进行至84h时，然后开机运行，并调整膜设备的压力及流量，使发酵液从出料口中流出进入膜分离单元，在膜分离装置中循环，随着含丙酸等有机酸组分的滤液不断渗出，原有的发酵液逐步得到浓缩，并使得菌体细胞与发酵清液分离开来，实现了菌体细胞的在线分离；分离的发酵清液从膜分离转置中进入丙酸分离单元的层析柱中进行丙酸分离，随着zgd630树脂对滤过清液中的丙酸等有机酸的不断吸附，使得滤液中的有机酸浓度逐渐降低，当丙酸浓度低至10g/l时，停止吸附，从层析柱中流出的废液回流至发酵单元的发酵罐中补入营养物质和费氏丙酸杆菌进行再次发酵，将层析柱中的zgd630树脂进行洗脱，可得到丙酸；而分离的菌体细胞进入维生素b12的转化单元，进入dmb进行维生素b12的转化生产。
实施例2：半连续发酵生产丙酸联产维生素b12的方法
(1)费氏丙酸杆菌的发酵培养
菌种活化培养：将甘油管或斜面保存的菌种进行平板划线活化，置于30℃恒温厌氧培养72h；
种子液培养：取活化后的斜面种子接入液体培养基中，30℃静置培养48h；
发酵罐培养：按照10％的接种量接种至10l发酵罐中，于30℃，50r/min条件下培养，当葡萄糖浓度低于10g/l时补加高浓度葡萄糖，同时用氨水调节ph为6.8-7.2，定期取样测定菌体的od600值。当发酵进行至84h时，胞内的维生素b12代谢中间体ado-cbi积累至最大值，此时发酵液的od600达到48，丙酸浓度达到了33.34g/l，开始进行菌体的膜分离；
(2)费氏丙酸杆菌菌体的膜分离
将膜分离设备中的各管道清洗干净，装入0.22μm卷式膜膜芯(0.12m2)。当费氏丙酸杆菌发酵进行至84h时，将发酵罐与膜分离设备连接，开机运行，调节压力为10bar，流量为8lpm，使发酵液在系统中循环。卷式膜的初始通量可达到55.63l/(h·m2)，随时发酵清液的滤出及菌体浓度的逐渐增大，通量逐渐下降，平均通量可达23.86l/(h·m2)。7l发酵液浓缩4倍时，滤出液为5.25l，需要2h；
取浓缩液进行稀释后，进行平板涂布，细胞存活率得到了99.5％；
(3)发酵液中丙酸的在线的吸附分离
将预处理好的阴离子交换树脂zgd630装填于层析柱中，树脂装填量为2.5l，并将层析柱的上样管道与膜分离设备的滤过液管道连接，使得膜分离设备的滤过清液上样至层析柱中，上样速度与膜分离设备的清液滤出速度相同，为2.86l/h，约为1.15bv/h。上样结束后，穿柱液中丙酸的含量为10.28g/l，zgd630树脂对丙酸的吸附载量达到了50.73mg/g；
(4)维生素b12的细胞离位浓缩转化
将膜分离得到的浓缩了4倍的费氏丙酸杆菌浓缩液转移至另一无菌的反应罐内，加入3.6mg/l的前体物质dmb，于30℃条件下转化72h，转化过程中用氨水调节ph为6.8-7.2，转化结束后，将转化液于10000r/min条件下离心收集菌体，使用醋酸盐缓冲液(ph3.5)重悬至原来体积，95℃热破碎30min，离心取上清，使用hplc分析维生素b12的产量，最终产量为53.9mg/l，ado-cbi转化率达78.8％，折算到发酵液的体积时，维生素b12的产量为13.48mg/l；
(5)费氏丙酸杆菌杆菌的半连续发酵
向步骤(4)中得到的部分移除丙酸后的发酵穿柱液中补加一定浓度的葡萄糖和玉米浆，使其浓度分别达到60g/l和41g/l，然后接入新鲜的种子培养液，继续进行发酵。当发酵进行至84h时，即维生素b12代谢中间体ado-cbi积累至最大值时，继续进行细胞的膜浓缩分离和丙酸的吸附移除，参照实施例1-4。
当将上述操作循环一次时，丙酸的浓度可达到55.87g/l，维生素b12的浓度达到了24.98mg/l。
实施例3：半连续发酵生产丙酸联产维生素b12的方法
(1)费氏丙酸杆菌的发酵培养
菌种活化培养：将甘油管或斜面保存的菌种进行平板划线活化，置于35℃恒温厌氧培养40h；
种子液培养：取活化后的斜面种子接入液体培养基中，35℃静置培养42h；
发酵罐培养：按照10％的接种量接种至10l发酵罐中，于35℃，30r/min条件下培养，当葡萄糖浓度低于10g/l时补加高浓度葡萄糖，同时用氨水调节ph为6-8，定期取样测定菌体的od600值。当发酵进行至80h时，胞内的维生素b12代谢中间体ado-cbi积累到最大值，此时发酵液的od600达到45，丙酸浓度达到了32.15g/l，开始进行菌体的膜分离；
(2)费氏丙酸杆菌菌体的膜分离
将膜分离设备中的各管道清洗干净，装入0.25μm卷式膜膜芯(0.34m2)。当费氏丙酸杆菌发酵进行至80h时，将发酵罐与膜分离设备连接，开机运行，调节压力为10bar，流量为8lpm，使发酵液在系统中循环。卷式膜的初始通量可达到52.16l/(h·m2)，随时发酵清液的滤出及菌体浓度的逐渐增大，通量逐渐下降，平均通量可达21.54l/(h·m2)。7l发酵液浓缩2倍时，滤出液为3.43l，需要2.5h；
取浓缩液进行稀释后，进行平板涂布，细胞存活率得到了99.3％；
(3)发酵液中丙酸的在线的吸附分离
将预处理好的阴离子交换树脂zgd630装填于层析柱中，树脂装填量为2.5l，并将层析柱的上样管道与膜分离设备的滤过液管道连接，使得膜分离设备的滤过清液上样至层析柱中，上样速度与膜分离设备的清液滤出速度相同，为2.86l/h，约为2.15bv/h。
上样结束后，穿柱液中丙酸的含量为8.65g/l，zgd630树脂对丙酸的吸附载量达到了46.52mg/g；
(4)维生素b12的细胞离位浓缩转化
将膜分离得到的浓缩了2倍的费氏丙酸杆菌浓缩液转移至另一无菌的反应罐内，加入1.8mg/l的前体物质dmb，于35℃条件下转化65h，转化过程中用氨水调节ph为6-7.5，转化结束后，将转化液于10000r/min条件下离心收集菌体，使用醋酸盐缓冲液(ph3.5)重悬至原来体积，95℃热破碎30min，离心取上清，使用hplc分析维生素b12的产量，最终产量为48.6mg/l，ado-cbi转化率达75.3％，折算到发酵液的体积时，维生素b12的产量为11.34mg/l；
(5)费氏丙酸杆菌杆菌的半连续发酵
向步骤(4)中得到的部分移除丙酸后的发酵穿柱液中补加一定浓度的葡萄糖和玉米浆，使其浓度分别达到60g/l和41g/l，然后接入新鲜的种子培养液，继续进行发酵。当发酵进行至84h时，即维生素b12代谢中间体ado-cbi积累至最大值时，继续进行细胞的膜浓缩分离和丙酸的吸附移除，参照步骤(1)-(4)。
当将上述操作循环一次时，丙酸的浓度可达到49.23g/l，维生素b12的浓度达到了20.12mg/l。
实施例4：半连续发酵生产丙酸联产维生素b12的方法
(1)费氏丙酸杆菌的发酵培养
菌种活化培养：将甘油管或斜面保存的菌种进行平板划线活化，置于25℃恒温厌氧培养80h；
种子液培养：取活化后的斜面种子接入液体培养基中，25℃静置培养48h；
发酵罐培养：按照10％的接种量接种至10l发酵罐中，于25℃，100r/min条件下培养，当葡萄糖浓度低于10g/l时补加高浓度葡萄糖，同时用氨水调节ph为6-8，定期取样测定菌体的od600值。当发酵进行至90h时，胞内的维生素b12代谢中间体ado-cbi积累到最大值，此时发酵液的od600达到43，丙酸浓度达到了30.23g/l，开始进行菌体的膜分离；
(2)费氏丙酸杆菌菌体的膜分离
将膜分离设备中的各管道清洗干净，装入0.1μm卷式膜膜芯(0.25m2)。当费氏丙酸杆菌发酵进行至90h时，将发酵罐与膜分离设备连接，开机运行，调节压力为10bar，流量为8lpm，使发酵液在系统中循环。卷式膜的初始通量可达到50.34l/(h·m2)，随时发酵清液的滤出及菌体浓度的逐渐增大，通量逐渐下降，平均通量可达20.12l/(h·m2)。7l发酵液浓缩4倍时，滤出液为4.42l，需要3h；
取浓缩液进行稀释后，进行平板涂布，细胞存活率得到了99.1％；
(3)发酵液中丙酸的在线的吸附分离
将预处理好的阴离子交换树脂zgd630装填于层析柱中，树脂装填量为2.5l，并将层析柱的上样管道与膜分离设备的滤过液管道连接，使得膜分离设备的滤过清液上样至层析柱中，上样速度与膜分离设备的清液滤出速度相同，为4.86l/h，约为3.43bv/h。
上样结束后，穿柱液中丙酸的含量为7.35g/l，zgd630树脂对丙酸的吸附载量达到了44.23mg/g；
(4)维生素b12的细胞离位浓缩转化
将膜分离得到的浓缩了4倍的费氏丙酸杆菌浓缩液转移至另一无菌的反应罐内，加入3.6mg/l的前体物质dmb，于25℃条件下转化80h，转化过程中用氨水调节ph为6-7.5，转化结束后，将转化液于10000r/min条件下离心收集菌体，使用醋酸盐缓冲液(ph3.5)重悬至原来体积，95℃热破碎30min，离心取上清，使用hplc分析维生素b12的产量，最终产量为48.6mg/l，ado-cbi转化率达73.2％，折算到发酵液的体积时，维生素b12的产量为10.25mg/l；
(5)费氏丙酸杆菌杆菌的半连续发酵
向步骤(4)中得到的部分移除丙酸后的发酵穿柱液中补加一定浓度的葡萄糖和玉米浆，使其浓度分别达到60g/l和41g/l，然后接入新鲜的种子培养液，继续进行发酵。当发酵进行至90h时，即维生素b12代谢中间体ado-cbi积累至最大值时，继续进行细胞的膜浓缩分离和丙酸的吸附移除，参照步骤(1)-(4)。
当将上述操作循环一次时，丙酸的浓度可达到45.12g/l，维生素b12的浓度达到了18.23mg/l。
从实施例2-4可以看出，本发明的费氏丙酸杆菌半连续发酵工艺，通过模块化单元操作和过程集成，采用再次接种的方法，完成半连续发酵，实现了维生素b12和丙酸的联产，丙酸的生产率可达45.12g/l以上，维生素b12生产率可达18.23mg/l以上。
对比例1：批次发酵
与实施例1相比，除了发酵进行至48h时，直接在发酵罐中添加dmb进行维生素b12的转化合成，没有将细胞与发酵液进行分离，其他条件与实施例1相同。
实施例2和对比例1的发酵周期相同，但实施例2的半连续发酵提高了丙酸和维生素b12的合成效率，结果如下表1所示：
表1
从实施例2和对比例1的对比可以看出，本发明方法提高了发酵效率和底物转化率，丙酸的转化率相比于批次发酵提高了33.98％，维生素b12转化率相比于批次发酵提高了44.56％。
综上所述，本发明方法和装置不仅有效解决了丙酸对发酵的反馈抑制作用，还克服了扩张床填充效率低，难以放大的劣势，不仅有效解决了丙酸对发酵的反馈抑制作用，还克服了扩张床填充效率低，难以放大的劣势，还有效解决了dmb添加对发酵废水资源化利用的不利影响，实现了发酵废液的循环利用。
本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。