一种包埋功能化纳米纤维膜的微流控芯片及其应用的制作方法

本发明属于细胞分选领域，特别涉及一种包埋功能化纳米纤维膜的微流控芯片及其应用。

背景技术：

随着人们生活方式的变化和人口老龄化趋势的加剧，癌症已经成为现代人类死亡的第一大因素。根据世界卫生组织的报告，2015年中国癌症新发肿瘤病例429.2万，死亡病例281.4万。这其中90％的癌症死亡病例都与肿瘤的转移密切相关。在肿瘤转移初期，肿瘤细胞从原发灶实体瘤上脱落，进入血液，成为循环肿瘤细胞(ctc)，有研究表明，许多肿瘤在直径一毫米的情况下，已可以在血液里查到ctc，且癌症病人外周血中的ctc数量与病情发展有紧密联系。因而，ctc的检测对于肿瘤的早期诊断、疾病发展预测、疗效评估、预后判断和个体化治疗具有极其重要的意义。

但血液中ctc的数目极其稀少(大约每10⁶～10⁷个白细胞中才有一个循环肿瘤细胞)，采用常规手段难以实现分离和捕获。例如：cellsearch是目前唯一获得美国食品药品监督管理局认可并用于ctc检测的商业化产品。但是cellsearch的技术同其他大多数阳性分选的方法一样，只能分离全血中上皮起源型的ctc，且检测成本高，以磁珠靶向结合ctc不利于后续的检测分析。阴性分选是以血液中的红细胞和白细胞为去除对象，通过去除白细胞和红细胞来实现ctc的分离和富集。与阳性分选方法相比，阴性分选不受肿瘤细胞表型的影响，适用于分选各种类型的肿瘤细胞，此外，阴性分选的方法省去了ctc释放的环节，减少循环肿瘤细胞的损伤，且操作简便，便于后续分析。尽管相比阳性分选，阴性分选的方法存在诸多优点，但在实际操作中利用阴性分选方法分离富集ctc依然存在较多问题，仍需要改进和提升。例如，bhuvanendran等人以磁性颗粒靶向结合白细胞，通过外加磁场分离去除白细胞，再以微孔滤膜过滤除去红细胞，最终实现ctc的分选。{s.bhuvanendrannairgourikutty,changchia-pin,danielpuiupoenar.anintegratedon-chipplatformfornegativeenrichmentoftumorcells.j.chromatogr.b,2016,1028,153-164.}diéguez等人利用微流控技术，在微流控通道内修饰白细胞抗体cd45靶向捕获白细胞，从而实现ctc细胞的阴性分选，并且通过硫酸腐蚀通道获得粗糙面，增加靶向位点，提高cd45抗体对白细胞的捕获效率。但该方法过程中损失了较多的ctc，最终得到的ctc回收率较低(仅为50％)，此外，硫酸腐蚀的方法易造成污染，且不能控制通道内部形貌。{l.diéguez,am.a.winter,ak.j.pocock,etal.efficientmicrofluidicnegativeenrichmentofcirculatingtumorcellsinbloodusingroughenedpdms.analyst,2015,140,3565-3572.}hyun等人采用鱼骨形微流控通道，直接以载玻片为底板，通过cd45抗体靶向结合白细胞，用于ctc的阴性分选。上述几种方法都是通过抗原-抗体(cd45抗体)结合的方式去除白细胞，结合力较弱、灵敏度低，白细胞捕获效率较低。{kyung-ahyun,taeyoonlee,hyo-iljung.negativeenrichmentofcirculatingtumorcellsusingageometricallyactivatedsurfaceinteractionchip.anal.chem.2013,85,4439-4445.}针对上述情况本发明以纳米纤维膜为底物，增加了靶细胞与基底的碰撞接触几率，并以生物素-亲和素为结合配体，结合力强，特异性高。

静电纺纳米纤维具有比表面积大、形貌可控以及易于功能化修饰等优点，将静电纺纳米纤维膜用于ctc的分离富集，可以增加细胞与靶向材料的碰撞接触几率，进而提高细胞的捕获效率。近年来，基于微流控芯片和纳米材料的检测平台受到了广泛的关注。微流控芯片具有样品需求量少、检测灵敏度高和分析速度快等优点，非常适合应用于细胞分选。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种包埋功能化纳米纤维膜的微流控芯片及其应用，该芯片针对循环肿瘤细胞传统分选方法存在的效率低、操作复杂、易损伤细胞等问题，利用表面功能化的纳米纤维特异性粘附血液中的白细胞，结合微流控分选技术，实现循环肿瘤细胞的高效分离。

本发明的一种包埋功能化纳米纤维膜的微流控芯片，包括玻璃底板、样品注入口、细胞捕获通道和储液池，所述功能化纳米纤维膜位于细胞捕获通道和玻璃底板之间；其中，功能化纳米纤维膜为表面修饰有链霉亲和素(streptavidin，sa)的纳米纤维膜。

所述细胞捕获通道内具有250-300个椭圆柱阵列。

所述纳米纤维膜为采用静电纺丝技术制备的plga纳米纤维膜。

静电纺丝工艺参数为：电压为20kv，接收距离为12cm，流速为0.4ml/h，单管喷头，环境温度为20-25℃，相对湿度为30-40％。

所述微流控芯片的四周为开有螺栓孔的有机玻璃板。

本发明还提供了一种包埋功能化纳米纤维膜的微流控芯片的应用，所述微流控芯片用于去除白细胞及阴性分选循环肿瘤细胞。

具体步骤如下：

(1)以表面修饰有sa的plga纳米纤维膜为基底，通过等离子处理将玻璃基底、plga纳米纤维膜与微流控通道键合，得到微流控芯片；

(2)将半胱氨酸(l-cysteine)溶液通入微流控芯片，再通入磷酸盐缓冲液(pbs)，得到表面钝化处理后的微流控芯片；

(3)取血液样品，利用红细胞裂解液去除血液中的红细胞，得到白细胞悬浮液，随后用4,6-联脒-2-苯基吲哚dapi对得到的白细胞进行染色，并用血球计数板对白细胞进行计数；再利用生物素化的白细胞抗体anti-cd45通过抗原-抗体结合对白细胞进行生物素标记，得到生物素标记的白细胞悬浮液；最后将白细胞悬浮液通入步骤(2)得到的微流控芯片，即可。

所述步骤(1)中的修饰sa的方法为：将plga纳米纤维膜放入到加有超纯水的染色缸中，利用二氯乙烷edc和n-羟基硫代琥珀酰亚胺nhs活化纳米纤维膜表面的羧基；逐滴加入浓度为1.25-1.5mg/ml的链霉亲和素溶液，磁力搅拌下反应2-3天，然后用超纯水对反应后的纳米纤维膜清洗，自然晾干，得到链霉亲和素功能化的plga纳米纤维膜。

将链霉亲和素功能化的plga纳米纤维膜按照长50mm、宽8mm的尺寸裁切，以匹配微流控通道尺寸。

所述步骤(2)中的半胱氨酸溶液的浓度为5mg/ml，通入时间为30min。

所述步骤(3)中的生物素化的白细胞抗体anti-cd45浓度为50μg/ml，与血液样品的体积比为1:50。

本发明将纳米纤维膜与微流控芯片相结合，针对循环肿瘤细胞传统分选方法存在的效率低、操作复杂、易损伤细胞等问题，利用表面功能化的纳米纤维特异性黏附血液中的白细胞，结合微流控分选技术，实现循环肿瘤细胞的高效分离。本发明有如下优点：第一，采用微流控通道包埋纳米纤维技术利用阴性捕获法将血液中的白细胞捕获，而直接分选出循环肿瘤细胞方法，适用于分选各种类型的肿瘤细胞，此外，该分选的方法省去了细胞释放的环节，减少循环肿瘤细胞损伤，且操作简便，便于后续分析。第二，传统抗体修饰，缺陷在于结合力低。该方法利用亲和素-生物素的特异性结合捕获白细胞，结合力强，特异性高。第三，阴性捕获法可以采用二级或多级芯片结构进行多次分选，使白细胞的捕获效率大大提高，进而提高癌细胞分离纯度。本发明操作简便，并且过程中使用的链霉亲和素方便易得，性质稳定，可以高效、无损分选循环肿瘤细胞。

有益效果

(1)本发明以plga-sa纳米纤维膜为基底，结合微流控技术，具有装置简易、重复性好的优点；

(2)采用链霉亲和素修饰的纳米纤维膜特异性捕获血液中的白细胞，不需要进行循环肿瘤细胞的后续释放，直接分选出高活性的循环肿瘤细胞，对肿瘤细胞没有损伤，过程操作简便、分离效率高；

(3)所需血液样品量少，检测效率高，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明用于阴性捕获循环肿瘤细胞的芯片(b)以及原理图(a)；

图2为本发明制备的plga静电纺纳米纤维的sem图(左)及直径分布图(右)；

图3为本发明制备的plga静电纺纳米纤维(a)、经过sa修饰后的plga纳米纤维(b)和sa粉末的红外光谱图(c)；

图4为本发明制备的plga纳米纤维、经过sa修饰的功能化后纳米纤维的热重分析图；

图5为本发明制备的plga静电纺纳米纤维、经过sa修饰后的plga纳米纤维和经过半胱氨酸修饰后的sa-plga纳米纤维的水接触角图像；

图6为本发明制备的plga静电纺纳米纤维、经过sa修饰后的plga纳米纤维和经过半胱氨酸修饰后的sa-plga纳米纤维的水接触角；

图7(a)为本发明制备的sa修饰的功能化静电纺plga纳米纤维对血液相容性的评价的紫外吸收图谱；(b)为(a)图在500-600nm处的放大图；

图8为本发明制备的sa修饰的功能化静电纺plga纳米纤维在不同的时间点的抗凝血行为；

图9为本发明制备的sa修饰的功能化静电纺plga纳米纤维微流控芯片对裂解红细胞后健康人全血在不同流速在(0.125ml/h、0.25ml/h、0.5ml/h、1.0ml/h、2.0ml/h)的动态捕获效率；

图10为该阴性捕获方法在0.25ml/h的流速下对全血中的循环肿瘤细胞的分离的效率；

图11为该阴性捕获方法对分离出来的癌细胞进行的免疫荧光染色鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

如图1所示，本实施例提供了一种包埋功能化纳米纤维膜的微流控芯片，具体如下：

(1)具有277个椭圆柱阵列的微流控芯片细胞捕获通道，通道的一端有样品注入口，另一端有出样口，进口和出口处以等腰三角的方式设计；(2)修饰有sa的plga静电纺丝纳米纤维膜，纳米纤维膜夹在载玻片和聚二甲基硅氧烷pdms通道的中间，形成夹层；(3)修饰有sa的纳米纤维膜，根据生物素-亲和素的结合，能特异性捕获血液中修饰有生物素的白细胞，从而将白细胞捕获在纳米纤维上，将循环肿瘤细胞流进回收液。

实施例2

plga静电纺纳米纤维的具体方法如下：

(1)称取1.0g的plga，将其溶于四氢呋喃(thf)和n，n-二甲基甲酰胺(dmf)的混合溶剂(thf和dmf的体积比为3：1)中，然后在磁力搅拌器下搅拌8小时左右，直到plga成为均一稳定的溶液为止，得到纳米纤维纺丝液浓度为25％(质量/体积)，冷却至室温存储在4℃冰箱中待用。

(2)将上述所制纺丝液缓慢吸取到注射器内，利用高压静电纺丝机和微量注射泵进行静电纺丝，纺丝条件为：温度20-30℃，湿度40-50％，电压20kv；接收距离12cm；液体流速0.4ml/h。所形成的纳米纤维膜通过覆盖有铝箔纸的平板装置接收。然后放入真空干燥箱中12-24h，得到plga纳米纤维。

(3)将制得的plga纳米纤维膜制样，然后通过扫描电镜仪(sem)对其进行形貌的观察。结果显示，获得的纳米纤维表面光滑，直径均匀，纤维平均直径为(773.1±172.0)nm(图2)，符合实验所需的纳米级纤维的要求。

实施例3

通过对修饰过的纳米纤维进行定性(图3)和定量(图4)分析，证明确实制得实验所需的功能化的plga纳米纤维，其修饰的具体步骤如下：

(1)将负载有plga纳米纤维膜的载玻片放入到染色架里，再把染色架浸泡在装超纯水的500ml染色缸中，加入edc的浓度为8.0mg/ml，活化30min，之后加入浓度为2.0mg/ml的nhs反应3小时，以此活化plga纳米纤维的羧基。

(2)将上述溶液倒掉换上新的超纯水，逐滴加入链霉亲和素溶液(1.25mg/ml)500ml，在磁力搅拌器作用下反应2天，然后用超纯水浸泡清洗3次，取出置于通风厨内自然晾干。分别对纯的plga纳米纤维膜，链霉亲和素以及功能化的纳米纤维膜进行红外表征，由红外吸收光谱图可知，sa成功地修饰到plga纳米纤维表面(图3)。然后再对修饰前后的纳米纤维膜进行热重分析，由热重分析图可知，plga纳米纤维膜表面修饰sa的量为11.7wt％(图4)。

实施例4

plga纳米纤维具有较强的疏水性，这在一定程度上也限制了其应用。通过水接触角测量仪研究了修饰sa前后plga纳米纤维的亲水性能。即，将负载有厚度均匀纳米纤维的载玻片放在载样台上，随机选取不同的部位，将仪器注射针头处3μl液滴滴在纤维毡上，通过测量软件测定接触角的大小，并将拍摄液滴形貌如图5所示，由此可知plga纳米纤维、修饰有sa的纳米纤维以及sa-lysteine纳米纤维的接触角在0s时分别为127.0±0.40°，41.2±1.0°和28.9±0.2°。图6所示为1min内各种材料上接触角的变化情况。这说明修饰后的纳米纤维具有较强的亲水性能。

实施例5

血液相容性是评定一种材料能否应用于捕获血液中存在ctcs的重要指标。通过溶血实验评价所制备的纳米纤维膜的血液相容性。

取1ml健康人的血液，离心5min(转速为1500r/min)，弃上清，用pbs洗涤沉淀5次，得红细胞。用pbs按照1:10的比例配置红细胞悬浮液，于4℃冰箱中备用。对照组将0.2ml红细胞悬浊液分别溶于0.8mlpbs中(阴性对照)和0.8mlh2o中(阳性对照)。然后，将所配置红细胞悬浮液再稀释10倍，将sa修饰后的plga纳米纤维按照质量体积比为2,4,5,6mg/ml浸入到稀释10倍后的红细胞悬浮液中，同一浓度下纳米纤维均取3个平行样，在37℃条件下孵育2h。最后取出纤维毡，将对照组及浸泡过纤维毡的红细胞悬浮液离心1min(10000r/min)，取上清液并用lamada25型紫外分光光度计对上清液在450-800nm处的吸光值进行测试(图7)，根据不同样品在540nm处的吸光值计算溶液率。

结果表明，在450-800nm范围内，对照组水中上清液的吸光值明显较高，这表明血红蛋白含量较高，即红细胞在水中完全涨破，出现严重的溶血现象。但在sa修饰后的plga纳米纤维和pbs中，上清液吸光值很低，说明未发生红细胞涨破。根据540nm处吸光值计算可知，当功能化的纳米纤维与人血红细胞悬浮液体积比2,4,5,6mg/ml时，材料的溶血率为(0.24±0.02)％，(0.36±0.21)％，(2.5±0.61)％,(4.1±0.73)％，其值均低于5％，表明该sa修饰后的plga纳米纤维均不能使人血细胞产生溶血现象，具有良好的血液相容性。

实施例6

为了验证sa修饰后的plga纳米纤维是否具有抗凝血性，采用动态凝血时间方法对功能化的纳米纤维进行抗凝血性能评价。

首先将sa修饰后的plga纳米纤维剪成圆形(φ＝14mm)，放入24孔板中，每个样品取4个平行样(对照组是tcp)。然后向每孔纤维毡以及对照组上滴加20μl健康人血液及10μlcacl2溶液(0.2mol/l)，置于37℃条件下孵育5、10、20、40、60min。在每个培养时间结束后，向每个孔板加入3ml蒸馏水，然后再孵育5min，用紫外分光光度计测定540nm的吸光值。

因为血红蛋白的含量越高代表发生凝固的血细胞越少，即材料的抗凝血性能越好。图8所示是sa修饰后的plga纳米纤维抗凝血性能的评价结果，对照组为tcp。在不同的时间点，sa修饰后的plga纳米纤维上清液中血红蛋白的吸光值均显著高于tcp，这说明sa修饰后的plga纳米纤维具有较好的抗凝血作用。

实施例7

为了验证sa修饰后的plga纳米纤维对血液中循环肿瘤阴性捕获的效果，对血液中的白细胞的特异性捕获，进行了不同流速下的捕获效率的测定，结果如图9所示。

(1)首先，以表面修饰有sa的plga纳米纤维膜为基底，通过等离子处理将玻璃基底、plga纳米纤维膜与微流控通道键合，得到微流控芯片。

微流控芯片包括：(1)具有277个椭圆柱阵列的微流控芯片细胞捕获通道，通道的一端有样品注入口，另一端有出样口，进口和出口处以等腰三角的方式设计；(2)修饰有sa的plga静电纺丝纳米纤维膜，纳米纤维膜夹在载玻片和聚二甲基硅氧烷pdms通道的中间，形成夹层；(3)修饰有sa的纳米纤维膜，根据生物素-亲和素的结合，能特异性捕获血液中修饰有生物素的白细胞，从而将白细胞捕获在纳米纤维上，将循环肿瘤细胞流进回收液。

(2)将浓度为5mg/ml的半胱氨酸(l-cysteine)溶液通入微流控芯片中30min，目的在于减少细胞的非特异性吸附，之后继续通入pbs溶液，目的在于把多余的半胱氨酸溶液冲洗干净。

(3)取1ml新鲜的健康人血液，离心5min(1500r/min)，去除血清，然后加入10倍的红细胞裂解液进行红细胞裂解，之后离心，弃上清。再用pbs溶液重悬浮细胞，进行再离心得到白细胞，以洗掉多余的细胞裂解液。然后用4，6-联脒-2-苯基吲哚dapi对血液中的白细胞进行染色，用血球计数板对血液中的白细胞进行计数，之后对血液中的白细胞和浓度50g/ml生物素化的抗体cd45(20μl)在37℃条件下进行孵育处理1h。之后，再加入pbs溶液，离心5min(1000r/min)，以洗掉多余的抗体。观察对白细胞的捕获效率。

(4)分别取1×10⁵个细胞在不同的流速下(0.125ml/h，0.25ml/h，0.5ml/h，1.0ml/h，2.0ml/h)通入到微流控通道，由于纳米纤维膜表面修饰有大量的链霉亲和素，而修饰过的白细胞表面含有大量的生物素，利用生物素和亲和素之间的结合力，当细胞在微流通道中沿着纤维表面流过时，细胞会被靶向捕获，粘附在纤维表面，而非靶向细胞就会流出通道，从而实现阴性分选循环肿瘤细胞的目的。

(5)在荧光显微镜下分别对不同流速下捕获的白细胞进行计数，求出白细胞的捕获效率(图9)。由图9可知随着流速的降低，白细胞的捕获效率提高。当流速为0.125ml/h时，捕获效率高达95％。当流速为2.0ml/h时，捕获效率为80％。

实施例8

为了验证sa修饰后的plga纳米纤维对血液中循环肿瘤阴性分离的效果，选取上述注射泵设定在0.25ml/h的流速下，进行如下实验操作。

(1)取1ml新鲜的健康人血液，离心5min(1500r/min)，去除血清，然后将稀释60倍的dapi(500μl)加入到血液中对白细胞进行染色10min，然后加入pbs溶液进行离心5min(1000r/min)，以去除多余未结合的染料。之后在血液中直接加入生物素化的抗体(50μl)进行孵育处理1h。

(2)选取a549细胞作为肺癌细胞的模型，取稀释60倍的钙黄绿素(c-am)20μl加入到a549细胞悬浮液中，37℃条件下孵育12min，之后，加培养液进行离心5min(1000r/min)，用细胞计数器对细胞进行计数，分别取50、100、200和300个a549细胞加入到上述健康人血液中。

(3)将步骤(2)中计好数的a549细胞分别加到步骤(1)的血液中，以0.25ml/h的流速通入微流控通道，收集回收液，在荧光显微镜下进行计数，得出循环肿瘤细胞的分离效率(图10)。由图10可知该装置满足对循环肿瘤细胞分选的需求，其循环肿瘤细胞的分离效率高达92.5％。

实施例9

为了验证sa修饰后的plga纳米纤维对血液中循环肿瘤细胞阴性分离的效果，取出口处的回收液利用免疫荧光染色对循环肿瘤细胞进行鉴定，具体操作如下。

(1)取2ml患者血液，首先对血液进行红细胞裂解处理，以去除红细胞。然后将稀释60倍的dapi(500μl)加入到血液中，对血液中剩余的细胞进行染色，然后再加入稀释50倍的fitc-anti-cd45(20μl)，之后再加入稀释50倍的ck7(10μl)。

(2)将步骤(1)处理过的血液通入微流控通道，在出口处收集回收液，在荧光显微镜下观察，如图11所示。由图11可知，根据癌细胞鉴别标准，dapi对所有的细胞都进行染色，anti-cd45只对白细胞进行染色，而ck7只能鉴别循环肿瘤细胞。由此可知，该微流控芯片能实现对血液中循环肿瘤细胞的分离的目的。