含多聚唾液酸复合纳米纤维膜及制备方法和应用与流程

本发明属于生物医学工程的组织再生领域，具体涉及一种含多聚唾液酸复合纳米纤维膜及其制备方法，以及含多聚唾液酸复合纳米纤维膜作为三维支架在脊髓损伤治疗中的应用。

背景技术：

脊髓损伤指由于机械创伤、肿瘤、炎症等原因造成脊髓横贯性损害进而导致肢体损伤面以下出现明显的运动和感觉丧失。在美国，每年大约有11000例新增脊髓损伤的病例，总共大约有250000例脊髓损伤患者。脊髓损伤的发生率呈逐年上升趋势，因脊髓损伤而产生的截瘫和四肢瘫患者也给家庭和社会带来沉重负担。脊髓损伤机制包括原发性损伤和继发性损伤。其中，原发性损伤通常指不可抗力造成的机械损伤，包括脊髓局部组织挫伤和压迫、神经细胞创伤性坏死、轴突纤维脱落等；继发性损伤发生于原发性损伤后期，脊髓局部微环境伴随一系列细胞病理性变化，包括急性炎症反应、水肿、局部微循环障碍、兴奋性氨基酸大量释放、脂质过氧化反应以及胞内钙离子超载等，最终导致神经细胞凋亡、胶质瘢痕和脊髓空洞的形成，严重影响患者运动学功能改善。原发性损伤难以有效干预，但对于继发性损伤，往往可以通过及时、合理的手术和药物治疗预防和减轻，提高患者生存质量。

临床上减轻继发性损伤的主要治疗方案是在患者脊髓损伤早期(8h内)静脉注射大剂量的肾上腺皮质激素甲基泼尼松龙进行冲击治疗，甲基泼尼松龙通过减少炎性物质的生成，抑制损伤部位的脂质过氧化反应稳定细胞生物膜，增加损伤脊髓的血液灌注，可以显著改善脊髓受损患者的神经功能；但由于传统给药方式如静脉注射等给药剂量大、毒副作用高，如肺部感染、消化道大出血和脓毒血症等，其临床应用受到较大争议和限制。为改善其治疗效果并降低其毒副作用，迫切需要开发新的给药系统，将甲基泼尼松龙有效地集中在受损部位。

近年来伴随大量基础研究的发展，多种新方案开始应用于脊髓损伤患者的康复治疗中，主要包括新型药物治疗、支架修复和细胞移植等。其中，利用支架修复的方法治疗脊髓损伤，可以结合药物治疗，实现药物原位释放从而有效避免药物在循环系统内迅速累积导致的毒副作用，并且其良好的三维孔隙结构有助于轴突再生并穿越损伤区域与远端建立联系，重构神经系统传导通路修复受损脊髓的功能，为我们开发甲基泼尼松龙原位给药系统提供了新思路。

支架修复的基本策略是在体外预先构建一个具有生物活性的三维骨架并将其植入组织受损部位，通过模拟细胞外基质环境为组织生长创造条件，修复受损神经功能。传统的支架制备技术多受限于工艺条件，较难按设想目标进行加工塑形，很难达到理想支架的状态，并且材料选择范围较窄。与常规支架相比，采用静电纺丝技术制备的纳米纤维膜与细胞外基质网状骨架结构存在更高的相似性；其特有的高孔隙率和比表面积有助于细胞的黏附和增殖；良好的孔隙通透性有助于支架与细胞外基质进行氧气、二氧化碳和小分子葡萄糖等物质交换；通过控制纤维的参数可以调节细胞在支架中的铺展、增殖和分化行为。目前，静电纺丝纳米纤维膜已经在骨、软骨、心脏以及血管等工程组织得到很多应用，在脊髓损伤治疗方面也有相关文献报道，通过模拟脊髓细胞外基质环境，提供神经轴突再生的附着点，促进轴突再生，引导再生轴突穿越损伤部位进入损伤远端而恢复受损脊髓的功能。此外，作为一种新型给药系统，静电纺丝技术制备的聚合物纳米纤维膜具有高比表面积，利用其作为载药材料，可以提高治疗药物的携载量，并使药物缓慢释放；另一方面，纳米纤维膜具有极佳的可加工性能，通过对纤维接收装置的改进可以直接制备成膜状、管状或层状结构，植入创伤部位后实现药物的局部给药。此外，通过控制电压条件和纺丝液参数可方便地调整纤维的直径与载药量等，较好地满足药物缓释体系的要求。

在支架制备的过程中，选择合适的支架材料是关键因素。传统的神经修复支架多为人工合成高分子材料，虽然生物相容性良好，但是自行降解不完全，需要在脊髓创伤愈合后通过二次手术从机体取出，增加了手术风险和患者痛苦。多聚唾液酸是一类线性、均一多聚α2,8连接唾液酸的内源性多糖聚合物，作为支架材料的潜在优势在于它可以在体内降解完全被吸收而无需进行二次手术。此外，多聚唾液酸具有诱导和支持神经元细胞再生的功能，它借助典型的n-连接糖苷键黏连在脊椎动物中枢神经系统神经黏附分子上，通过改变神经黏附分子的黏附性调节神经细胞发育、神经导向及突触形成，从而在神经发育中起到关键作用，在神经修复支架领域具备良好的应用前景。此外，许多生物高分子材料也广泛应用于纳米纤维膜的制备，聚己内酯是一种被美国食品药品监督管理局批准的可生物降解的聚酯类高分子材料，由于其良好的生物相容性、较慢的降解速率以及出色的力学性能，作为组织工程支架材料治疗脊髓损伤可以长期维持支架三维结构的稳定，为神经细胞的黏附和增殖创造条件。

本发明是在充分考虑脊髓损伤的发病机制和临床治疗现状等特点的基础上提出的，选取生物相容性材料聚己内酯为支架主体成分，在此基础上，复合多聚唾液酸，发挥神经调节作用；同时添加传统肾上腺皮质激素药物甲基泼尼松龙发挥抗炎作用。本发明的含多聚唾液酸复合纳米纤维膜作为三维支架应用于脊髓损伤治疗，可以抑制脊髓全横断模型大鼠的继发性脊髓损伤，促进神经纤维再生和运动学功能改善。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供含多聚唾液酸复合纳米纤维膜，该纤维膜由聚己内酯、甲基泼尼松龙和四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸组成，其中聚己内酯的质量百分比为40-98％，重均分子量为50000-150000da；甲基泼尼松龙的质量百分比为1-40％；四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸的质量百分比为1-20％，重均分子量为89000-267000da。

本发明的另一目的是提供含多聚唾液酸复合纳米纤维膜的制备方法，具体通过以下步骤实现：

(1)称取1g四丁基溴化铵溶解在20ml的去离子水中，加入1g阳离子交换树脂(dowex50wx2)后,室温搅拌2h，离心收集阳离子交换树脂，并用去离子水洗涤3次；然后，称取200-950mg的多聚唾液酸(重均分子量为5000-100000da)溶解在20ml的去离子水中，加入上述收集的阳离子交换树脂，并室温搅拌2h，离心去除阳离子交换树脂，取上清，并用去离子水洗涤树脂3次，洗涤液合并至上清，冷冻干燥得四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸。

(2)分别称取占总组分质量百分比40-98％的聚己内酯(重均分子量50000-150000da)、1-40％的甲基泼尼松龙、1-20％的四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸(8900-178000da)溶解在有机溶剂中(总质量浓度可为100-250mg/ml)，40℃搅拌24h，使之形成稳定、透明、均匀的溶液；采用喷丝头内径0.5-1.5mm、注射流量0.5-2.0ml/h、输出电压15-30kv、电纺间距10-20cm的条件，进行静电纺丝，得到含多聚唾液酸复合纳米纤维膜。

以上方法中所述溶剂选自n，n-二甲基甲酰胺和丙酮的任意一种或其任意比例的混合物。

本发明的再一目的是提供上述含多聚唾液酸复合纳米纤维膜作为三维支架在脊髓损伤治疗中的应用，可抑制脊髓全横断模型大鼠的继发性脊髓损伤，促进神经纤维再生和运动学功能改善。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

所述含多聚唾液酸复合纳米纤维膜含聚己内酯、甲基泼尼松龙和四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸三种组分，可作为三维支架应用于脊髓损伤治疗；生物相容性材料聚己内酯为支架主体成分，甲基泼尼松龙通过减少炎症因子释放抑制继发性脊髓损伤，四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸通过调节神经黏附分子的黏附性促进神经纤维修复和运动学功能改善。

所述含多聚唾液酸复合纳米纤维膜采用的四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸是由多聚唾液酸与四丁基溴化胺阳离子交换后得到，可以提高多聚唾液酸在有机溶剂中的溶解度，为所述含多聚唾液酸复合纳米纤维膜的制备创造条件。纤维膜通过静电纺丝技术制备得到，纤维结构与细胞外基质网状骨架结构存在较高的相似性，且制备工艺便捷，重复性好，产物产率高，可适用于工业化生产。

附图说明

图1是实施例5制备的含多聚唾液酸复合纳米纤维膜在扫描电子显微镜下的形貌图，纳米尺寸的纤维交错无定向排列，孔隙结构丰富，且纤维结构完整无串珠状结构。

图2是大鼠脊髓损伤后髓鞘在透射电子显微镜下的超微结构图，采用含多聚唾液酸复合纳米纤维膜治疗脊髓损伤后局部组织视野可见大量的有髓神经纤维，纤维和髓鞘形态基本正常，超微结构明显优于其余各治疗组，表明含多聚唾液酸复合纳米纤维膜具有明显的神经纤维修复效果。

图3是大鼠脊髓损伤后运动学功能评分图(*表明p＜0.05，显著性差异)，采用含多聚唾液酸复合纳米纤维膜治疗脊髓损伤后大鼠运动学功能在7周后显著优于其余各治疗组，表明多聚唾液酸复合纳米纤维膜可以有效改善大鼠脊髓的运动学功能。

具体实施方式

下面将根据具体的实施例和附图对本发明作进一步的详细说明，但不应将本发明限制在所述的实施例范围之内。

实施例1

称取1g四丁基溴化铵溶解在20ml的去离子水中，加入1g阳离子交换树脂(dowex50wx2)后,室温搅拌2h，离心收集阳离子交换树脂，并用去离子水洗涤3次；然后，称取200mg的多聚唾液酸(重均分子量为5000da)溶解在20ml的去离子水中，加入上述收集的阳离子交换树脂，并室温搅拌2h，离心去除阳离子交换树脂，取上清，并用去离子水洗涤树脂3次，洗涤液合并至上清，冷冻干燥，即得四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸，凝胶渗透色谱法测得重均分子量为8560。

实施例2

称取1g四丁基溴化铵溶解在20ml的去离子水中，加入1g阳离子交换树脂(dowex50wx2)后,室温搅拌2h，离心收集阳离子交换树脂，并用去离子水洗涤3次；然后，称取600mg的多聚唾液酸(重均分子量为12000da)溶解在20ml的去离子水中，加入上述收集的阳离子交换树脂，并室温搅拌2h，离心去除阳离子交换树脂，取上清，并用去离子水洗涤树脂3次，洗涤液合并至上清，冷冻干燥，即得四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸，凝胶渗透色谱法测得重均分子量为22400da。

实施例3

称取1g四丁基溴化铵溶解在20ml的去离子水中，加入1g阳离子交换树脂(dowex50wx2)后,室温搅拌2h，离心收集阳离子交换树脂，并用去离子水洗涤3次；然后，称取950mg的多聚唾液酸(重均分子量为100000da)溶解在20ml的去离子水中，加入上述收集的阳离子交换树脂，并室温搅拌2h，离心去除阳离子交换树脂，取上清，并用去离子水洗涤树脂3次，洗涤液合并至上清，冷冻干燥，即得四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸，凝胶渗透色谱法测得重均分子量为185000da。

实施例4

分别称取占总组分质量百分比为40％的聚己内酯(重均分子量50000)、40％的甲基泼尼松龙和20％的实施例1制备得四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸共计1g，溶解在10ml丙酮中，40℃搅拌24h，使之形成稳定、透明、均匀的纺丝液；在喷丝头内径0.5mm、注射流量0.5ml/h、输出电压15kv、电纺间距10cm的条件下进行静电纺丝，得到含多聚唾液酸复合纳米纤维膜。扫描电子显微镜下观察纤维结构完整无串珠状结构，imagej统计纤维直径为103±15nm。

实施例5

分别称取占总组分质量百分比为75％的聚己内酯(重均分子量80000)、20％的甲基泼尼松龙和5％的实施例2制备得四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸共计2g，溶解在10mln，n-二甲基甲酰胺与丙酮体积比为1:1的混合溶剂中，40℃搅拌24h，使之形成稳定、透明、均匀的纺丝液；在喷丝头内径1.0mm、注射流量1.0ml/h、输出电压20kv、电纺间距15cm的条件下进行静电纺丝，得到含多聚唾液酸复合纳米纤维膜。扫描电子显微镜下观察(图1)纤维结构完整无串珠状结构，imagej统计纤维直径为504±20nm。

实施例6

分别称取占总组分质量百分比为60％的聚己内酯(重均分子量100000)、20％的甲基泼尼松龙和20％的实施例2制备得四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸共计1.5g，溶解在10mln，n-二甲基甲酰胺与丙酮体积比为5:1的混合溶剂中，40℃搅拌24h，使之形成稳定、透明、均匀的纺丝液；在喷丝头内径1.2mm、注射流量1.5ml/h、输出电压25kv、电纺间距15cm的条件下进行静电纺丝，得到含多聚唾液酸复合纳米纤维膜。扫描电子显微镜下观察纤维纤维交错无定向排列并有少量串珠结构，imagej统计纤维直径为435±43nm。

实施例7

分别称取占总组分质量百分比为89％的聚己内酯(重均分子量150000)、10％的甲基泼尼松龙和1％的实施例3制备得四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸共计2.3g，溶解在10mln，n-二甲基甲酰胺与丙酮体积比为3:1的混合溶剂中，40℃搅拌24h，使之形成稳定、透明、均匀的纺丝液；在喷丝头内径1.2mm、注射流量1.0ml/h、输出电压30kv、电纺间距15cm的条件下进行静电纺丝，得到含多聚唾液酸复合纳米纤维膜。扫描电子显微镜下观察纤维结构完整无串珠状结构，imagej统计纤维直径为815±67nm。

实施例8

分别称取占总组分质量百分比为98％的聚己内酯(重均分子量120000)、1％的甲基泼尼松龙和1％的实施例3制备得四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸共计2.5g，溶解在10mln，n-二甲基甲酰胺中，40℃搅拌24h，使之形成稳定、透明、均匀的纺丝液；在喷丝头内径1.5mm、注射流量2.0ml/h、输出电压30kv、电纺间距20cm的条件下进行静电纺丝，得到含多聚唾液酸复合纳米纤维膜。扫描电子显微镜下观察纤维纤维交错无定向排列并有少量串珠结构，imagej统计纤维直径为905±28nm。

应用实施例

本应用例是将实施例5制备的含多聚唾液酸复合纳米纤维膜应用于体内脊髓损伤治疗效果实验，具体包括以下步骤：

(1)建立大鼠脊髓全横断模型

以雌性sd大鼠为模型动物，依次切开皮肤、皮下组织，钝性剥离并向两侧牵开双侧椎旁肌，显露t9-t10椎体，咬除t9-t10棘突及椎板，暴露硬脊膜，将充分暴露的脊髓用显微眼科刀快速横断，并反复多次以确保脊髓全横断，以大鼠痉挛性摆尾、双下肢及躯体回缩扑动后双下肢抖动瘫痪为造模成功的标志。随机分为6组，每组12只大鼠。组1未植入纤维膜，组2植入空白聚己内酯纤维纤维膜，组3植入聚己内酯/甲基泼尼松龙复合纳米纤维膜(200μg甲基泼尼松龙/只)，组4植入聚己内酯/四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸复合纳米纤维膜(75μg四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸/只),组5植入聚己内酯/甲基泼尼松龙/四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸复合纳米纤维膜((200μg甲基泼尼松龙+75μg四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸)/只)，组6为未处理正常大鼠。

(2)大鼠脊髓损伤部位炎症因子测定

术后24h，大鼠用2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开腹腔，剪破右心耳，ph7.4磷酸盐缓冲液心脏灌流200ml后完整剥离脊髓，取脊髓断端前后各1cm研磨制备组织上清液，采用elisa法测定炎症因子肿瘤坏死因子tnf-α和白介素il-6含量。结果显示，组6正常大鼠脊髓组织的tnf-α和il-6含量分别为0.63±0.07和2.27±0.60ng/mg，组1脊髓损伤部位的tnf-α和il-6含量与组6相比显著增高(p＜0.05)，分别为1.81±0.21和9.76±0.58ng/mg，移植含多聚唾液酸复合纳米纤维膜后组5脊髓损伤部位tnf-α和il-6含量与组1相比显著降低(p＜0.05)，分别为1.03±0.03和5.59±0.97ng/mg，表明含多聚唾液酸复合纳米纤维膜通过减少脊髓全横断模型大鼠的炎症因子释放可以有效抑制继发性脊髓损伤。

(3)大鼠脊髓损伤部位神经纤维修复效果评价

术后7周，大鼠用2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开腹腔，剪破右心耳，ph7.4磷酸盐缓冲液心脏灌流200ml后完整剥离脊髓，用手术刀片切成1mm³小块置于2.5％戊二醛中，4℃固定并进行锇酸处理、乙醇梯度脱水、树脂包埋、染色切片等操作，透射电子显微镜下观察髓鞘超微结构。

如图2所示，正常组视野中可见大量厚度均匀、板层状结构清晰完整的髓鞘紧密排列，纤维形态完好。组1由于区域坏死脱落造成视野中大片空白结构区,完整髓鞘的数目较少，

部分髓鞘发生空泡样病变并存在明显扩大的轴突间隙，神经纤维结构不完整；相比于组1，组2脊髓髓鞘数量有一定增加，髓鞘板层状结构尚不清楚，厚度不均匀，部分纤维萎缩；组3、组4髓鞘数量显著增加，大部分有髓神经纤维结构完整，髓鞘板层状结构清楚，厚度均匀，部分髓鞘有轻微的异常诸如板层部分分离；组5可见大量的有髓神经纤维，纤维和髓鞘形态基本正常，超微结构明显优于其余各治疗组，表明含多聚唾液酸复合纳米纤维膜的神经纤维修复效果最显著。

(4)大鼠运动学功能评价

采用运动学功能评分(见下表1)对脊髓损伤大鼠的运动学功能进行定期检测，分别于1天、3天、5天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周记录大鼠的运动学功能评分，结果见图4。运动学功能评分反映大鼠的运动学功能，评分越高代表运动学功能改善效果越明显(*表明p＜0.05，显著性差异)。

如图3所示，组2对脊髓损伤大鼠运动学功能的治疗效果有限；在损伤部位导入甲基泼尼松龙治疗，组3的运动学功能评分在3周内提高明显；进一步导入四丁基溴化铵修饰多聚唾液酸治疗，组5的运动学功能评分在7周后显著高于其余各治疗组，运动学功能有进一步改善，表明含多聚唾液酸复合纳米纤维膜的治疗效果最显著。

表1