一种获得鳙性别特异分子标记及其筛选方法和应用与流程

本发明隶属于生物技术领域，涉及鱼类性别特异分子标记、及其筛选方法和应用。

背景技术：

在脊椎动物中，鱼类进化出了最多样化的性别决定机制。在一些鱼类中，性别是由遗传因素决定的，即它们在孵化的时候就有了确定的性别；但是另一些鱼类的性别却很大程度受环境的影响，如温度、ph、盐度等外界环境条件；鱼类最终的性别是遗传、环境及二者互作的结果(devlinetal.sexdeterminationandsexdifferentiationinfish:anoverviewofgenetic,physiological,andenvironmentalinfluences.aquacμlture,2002,208(3):191-364.)。遗传因素性别决定的鱼类主要被分为两种类型，即xx/xy型和zw/zz型。第一种类型的鱼雄性含有性别决定区域或性染色体，而第二种类型的鱼，性别决定区域或性染色则位于雌性鱼的基因组中。确定一个物种的性别决定机制，通常通过以下三种方法：a.从细胞遗传学的核型分析中寻找性别染色体；b.在实验室中培育性反转个体；c.发掘性别特异的分子标记(gambleetal.identificationofsex‐specificmolecμlarmarkersusingrestrictionsite‐associateddnasequencing[j].molecμlarecologyresources,2014,14(5):902-913.)。前两种方法在鱼类性别鉴定中都有较大难度，例如大多数鱼类还没有形成像哺乳类动物那样的可以从视觉上区别的性别染色体；而且很多鱼类由于繁殖周期和养殖条件等原因在实验室条件下较难培育性反转群体，这就使得开发性别特异分子标记成为最有前途的研究鱼类性别机制的方法。

鳙(hypophthalmichthysnobilis)是我国四大家鱼之一，是我国重要的经济养殖鱼类。据世界粮农组织(fao)2015年统计，鳙全世界范围内养殖产量达到340万吨，2015年国内鳙的产量已经上升到336万吨，占全世界总养殖产量的98.72％，鳙产量位列我国淡水养殖鱼类总产量的第三位。随着我国居民生活水平的提高，对鱼肉等优质蛋白质的需求越来越大，这将进一步刺激国内鳙养殖业的发展。鳙的性成熟年龄在我国中部和南方约需4-5年，北方至少需6年以上。由于鳙性成熟钱从外观上无法鉴别其性别，性成熟个体也只有在繁殖季节通过其所产配子类型才可准确鉴定其性别，这给鳙的生产和繁殖造成了极大不便。为了在性成熟前提前鉴定鳙的性别，亟需开发鳙性别特异分子标记。

简化基因组测序(restrictionsiteassociateddnasequencing,rad-seq)是最近几年发展起来的将酶切和高通量测序相结合的一种技术。它可以通过不同的内切酶，在基因组中酶切产生特异切口片断，将这些片断富集之后作为模板，构建高通量测序文库，然后借助高通量测序，获得大量酶切片断的序列。这种方法既可以获得基因组中大量特定片断，又降低了测序成本，已经成为一种通用而高效的遗传分型方法(daveyetal.genome-widegeneticmarkerdiscoveryandgenotypingusingnext-generationsequencing.natrevgenet.2011.12,7499-510)。虽然该方法已成功运用在多种动物和植物的性别遗传标记开发中，但它还是存在一些明显的缺点，例如它鉴定出来的通常为性别相关snp标记，存在遗传分型方法比较复杂等不足(carmichaeletal.identificationofasex-linkedsnpmarkerinthesalmonlouse(lepeophtheirussalmonis)usingradsequencing.plosone.2013.8,10,e77832)。

技术实现要素：

针对现有技术中不易鉴定鳙幼鱼性别的缺陷，本发明提供一种鳙性别特异分子标记的筛选方法，并应用该方法鉴定到一条雄鳙特异长序列，基于该长序列开发出一种简便、快速、可靠鉴定鳙的性别的方法，为批量鉴定鳙性别奠定技术基础。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明的第一方面提供一种鳙性别特异分子标记的筛选方法，包括如下步骤：

(1)雄鳙特异短序列的鉴定

利用本实验室已有的已知性别的5雌5雄鳙为样品，取尾鳍提取基因组dna，按照2b-rad方法进行测序文库构建，测序文库检验合格之后上机进行测序；对测序数据进行过滤之后，使用stacksv1.31进行性别特异序列鉴定，得到一个序列在5尾雄鳙中均出现，但是在5尾雌鳙中均没出现，此序列即雄鳙特异短序列，其核酸序列为seqidno:1；

(2)雄鳙基因组测序

步骤(1)中鉴定到的短序列仅有32bp，无法进行普通pcr引物设计，因此需要更长的基因组序列。于是对5尾雄鳙中的一尾进行高通量全基因组测序，然后使用soapdenovov1.2.0软件进行从头组装，获得雄鳙全基因组序列；

(3)将(1)中获得的雄鳙特异短序列在(2)中获得的雄鳙全基因组序列中进行blast比对搜索，获得一条922bp的长序列，此序列的核酸序列为seqidno:2。

本发明的第二方面，提供一种鳙性别特异分子标记，其核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明的第三方面，提供一种鳙性别特异分子标记seqidno:2在鳙性别鉴定中的应用。

本发明的第四方面，提供一种快速检测鳙性别差异的引物，以seqidno:2为模板进行pcr引物设计，获得一对能够分辨鳙性别的引物，引物名称为ars-9-1f和ars-9-1r，引物序列如seqidno:3和seqidno:4所示。

本发明的第五方面，提供一种用所述鳙性别特异分子标记的遗传性别鉴定方法，包括如下步骤：

(1)采集待测鳙的基因组dna；

(2)用所述鳙性别特异分子标记的引物对鳙基因组dna进行pcr扩增，扩增得到366bp的条带所对应的为雄性个体，没有扩增条带所对应的为雌性个体。

进一步地，所述步骤(2)中的pcr反应的体系为：dna模板1μl(50ng/μl)，上下游引物5μmars-9-1f和ars-9-1r混合物0.4μl，2.5mmdntp0.4μl，10xbuffer1.25μl，5u/μltaq酶0.075μl，补充水至12.5μl。

进一步地，所述步骤(2)中的pcr扩增程序为：

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

(1)本发明所提供的遗传性别鉴定方法能够以基因组dna为模板，仅仅通过简单的pcr和电泳结果就能够进行性别的鉴定。该方法不受个体发育时期、环境的影响，从而克服其他方法操作较繁琐、耗时较长等缺点，尤其适合于对大样本进行快速鉴定。

(2)本发明成本低、操作简单、快速、准确，并适合于推广应用。

附图说明

图1为利用已知性别鳙对引物ars-9-1进行准确性验证，

图2为利用引物ars-9-1对雌核发育鳙子代进行性别鉴定，

图中所示雌核发育鳙子代均为雌性，验证了鳙性别决定机制为xx/xy型。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】雄鳙特异短序列的鉴定

本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、扩增、回收和分析。

酶切：

对本实验室养殖的且已知性别的5雌5雄鳙进行2b-rad建库，具体过程如下(以下为每个个体使用量)：

混匀之后37.0℃下酶切反应4小时,然后65℃保温20分钟使酶灭活。

连接：

测序接头连接。将上面的酶切产物与标准的illumina测序接头(slx-ad1和slx-ad2)分别进行连接反应，反应体系(27.0μl)：

混匀离心后置于16℃下连接反应过夜(8h)。

扩增：

pcr反应体系包含两对pcr引物(slx-1st-primer1&slx-1st-primer2,slx-2nd-primer&slx-barcodeprimer),其中in-rad-barcodeprimer为带有特异性barcode的引物，使每个个体构建文库的barcode不同，用来后续数据分析区分个体。pcr反应体系如下：

每个样品按如上体系平行扩增2管。混匀离心后置于pcr仪中，反应条件为：98℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环98℃变性20s，63℃退火50s，72℃延伸40s，最后在72℃下终延伸5min，4℃保存。

回收：

合并扩增产物通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测切胶回收片段大小约170bp的文库产物。使用omegapoly-geldnaextractionkit(d2561-02)对回收产物进行纯化，具体操作流程参照试剂盒说明书，最终用30μl超纯水洗脱。使用荧光定量pcr对每个样品进行定量，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为illuminahiseq2500se50(illμmina,usa)。建库过程所使用的接头及引物序列详见表1。

表12b-rad测序文库构建接头及引物序列

分析：

对10尾亲本进行2b-rad测序，一共得到30.9mreads的原始数据和过滤后的26.7m高质量reads。从5个母本中测得16.1m条高质量reads，从5个父本测得10.6m条高质量reads。对测序下机产生的fastq格式序列进行过滤之后，使用stacksv1.31软件进行位点重建和性别特异位点的鉴定。最后获得一个雄鳙特异的短序列，此序列在5尾雄鳙中均存在，但是在5尾雌鳙中都不存在。其核酸序列为seqidno:1。

【实施例2】雄鳙全基因组测序及雄鳙特异短序列的延长

a)从5尾雄鳙中选择一尾进行小片段文库构建并用于illumina全基因组测序。测序获得48.2mpe150bp的illumina原始序列，然后使用soapdenovov1.20进行全基因组组装；

b)将实施例1中鉴定到的雄鳙特异短序列在全基因组中进行blast比对搜索，获得一条长911bp的长序列，其核酸序列为seqidno:2。

【实施例3】基于雄鳙特异长序列的性别引物设计及验证

a)依据seqidno:2设计一对性别引物，其序列为：

ars-9-1f:gctccttactcagcaact

ars-9-1r:tcagtaaacagacgagca

b)从本实验室养殖的已知性别的鳙群体中选择30尾，包括15尾雄性和15为雌性，对其基因组dna样品进行pcr验证，pcr反应程序如下：

pcr加样信息

pcr程序设置

所述的电泳分析，其方法是：将变性好的扩增产物用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件：电压230v，时间2小时；然后对电泳产物通过溴化乙锭(eb)染色对dna条带进行观察、照相和分析。结果如图1所示，雄鱼可扩增出特异的366bp大小的核苷酸片段，雌鱼则无此扩增产物。共验证30尾，其中雌性15尾，雄性15尾。

b)使用本实验室繁殖的30尾鳙雌核发育群体进行验证，验证条件如本实施例步骤a所示，结果如图2。共验证30尾雌核发育个体，全为雌性。

sequencelisting

<110>中国科学院水生生物研究所

<120>一种鳙性别特异分子标记及其筛选方法和应用

<160>4

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<210>1

<211>32

<212>dna

<213>鳙

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<213>人工序列

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