一种检测黄牛SERPINA3基因单核苷酸多态性的方法及其应用与流程

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性的检测，特别涉及一种检测黄牛serpina3基因单核苷酸多态性的方法及其应用。

背景技术：

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组dna序列中由于单个核苷酸(a/g/c/t)的变化而引起的多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的snps约占2/3。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的snps，基因编码区内的snps(csnps)比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。

标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(qtl)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与qtl间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。snp作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。分子育种，即分子标记辅助选择(molecularmark-assistselection,mas)，该技术是借助dna分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在畜禽育种中，人们期望，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的dna标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(sscp)、pcr-rflp和直接测序技术等，pcr-rflp是目前广泛应用的一种分子标记检测方法，是分类研究的有效手段。生物在长期的进化过程中，在种、属乃至品种间同源dna序列中的某一位点上，由于发生插入、缺失、倒位、易位或单碱基突变等都会造成该处限制性内切酶识别位点的增加或减少。因而，当用某一特定的限制酶酶切dna时，在该位点上就会产生酶切dna片段长度的差异，这种差异可反映在电泳图谱上，并可通过southern印迹杂交进行检测。

rflp连锁分析是将pcr扩增后的目的片段，用限制性内切酶酶切，由于酶切位点及其位置的不同，酶切后会产生不同长度的片段，然后进行凝胶电泳，通过不同带型对多态性的dna进行初步分离。该方法简单，易于操作，是最早用于多态性分析的方法，适用于多态性初步筛选。

丝氨酸蛋白酶抑制蛋白3(serpina3)属丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族a亚型，由423个氨基酸组成，含有一个位于n端的信号肽和一个具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的serpin结构域，c端含有一个具有23个氨基酸长度的活性反应中心环；相对分子质量为55000～66000，具有多个糖基化位点，但这些糖基化位点不参与丝氨酸蛋白酶抑制剂功能。

丝氨酸蛋白酶抑制蛋白3(serpina3)在多种恶性肿瘤中有异常表达。该蛋白结合dna聚合酶和dna引物，抑制dna过度复制，从而抑制细胞恶变，当蛋白结构中关键部位发生突变，其功能发生改变，抑制细胞凋亡，导致肿瘤的发生。人serpina3基因位于染色体14q32.1，编码的serpina3蛋白是典型的急性炎症反应蛋白，受炎性细胞因子的调控，在炎症反应时明显增加。serpina3基因的启动子受3种转录因子(sp1、mzf1和zbtb7b)的转录激活，而serpina3基因的转录水平则受到位于启动子内部的单核苷酸多态性(rs1884082)的影响(chelbietal.2012)。故在炎症反应时，炎性细胞因子通过以上3种转录因子调控serpina3基因序列中的单核苷酸多态性，从而调节基因表达，促进急性炎症反应蛋白serpina3的合成。

目前尚未见到以黄牛serpina3基因单核苷酸多态性位点作为分子育种中分子标记以加快育种进程的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测黄牛serpina3基因单核苷酸多态性的方法及其应用，通过对于与经济性状关联的snp分子标记的检测，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛serpina3基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

以待测黄牛全基因组dna为模板，以引物对p1为引物，pcr扩增黄牛serpina3基因部分片段；利用琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物片段大小(184bp为目的扩增片段)；用限制性内切酶bstxi酶切pcr扩增产片段之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛serpina3基因第648位的单核苷酸多态性位点的基因型；

所述的引物对p1为：

上游引物：5’-tggctggagggatgtgacta-3’；

下游引物：5’-tcattattggttcaccataa-3’；

所述的pcr扩增的反应程序为：

95℃预变性5min；94℃变性30s，51.8℃退火30s，72℃延伸40s，共38个循环；72℃延伸10min。

利用琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物片段大小时，所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5％。

利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后片段大小时，所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛serpina3基因第648位的单核苷酸多态性为：aa基因型表现为148bp一个条带；ag基因型表现为148bp、130bp和18bp三个条带；gg基因型表现为130bp和18bp两个条带；其中，gg基因型为突变纯合基因型。

上述检测黄牛serpina3基因单核苷酸多态性的方法可应用于黄牛分子育种以及不同黄牛群体多态性的鉴定中。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的检测方法以与黄牛生长性状关联的serpina3基因的snp为对象，可以快速、准确、低成本的实现对于黄牛个体相应snp的多态性检测，且该snp的多态性与黄牛群体中不同个体间在胸围和管围上的性状差异密切相关。因此能够作为潜在的分子标记位点，用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，以便快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1是本发明pcr扩增片段的琼脂糖凝胶电泳结果；泳道1-5分别代表不同黄牛个体的pcr扩增产物；泳道m为markeri，条带自下而上分别为100、200、300、400、500、600bp。

图2是本发明pcr扩增产物经混合测序筛查到的黄牛serpina3基因序列第648位a-g突变测序结果图(黑色箭头所指处为单核苷酸突变a>g位置)。

图3是本发明pcr扩增片段酶切后琼脂糖凝胶电泳结果；泳道1-6分别代表基因型gg、ag、ag、aa、aa和ag的电泳条带，m为markeri，条带自下而上分别为100、200、300、400、500、600bp。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明首先根据ncbi公布的牛serpina3基因序列设计引物，分别以多个黄牛品种的基因组dna为模板，进行pcr扩增，混合pcr产物并对其测序。然后，进行测序图分析和序列比对，筛查出snp位点，即：在黄牛的serpina3基因序列第648位为a>g的碱基多态性；其次，对待测黄牛个体进行多态位点的pcr-rflp检测；最后，根据在群体不同个体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与黄牛生长性状密切相关的分子标记。

针对上述第648位的snp，本发明还公开了其具体的pcr-rflp检测方法：进行pcr扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物片段大小，用限制性内切酶bstxi处理扩增片段后进行琼脂糖凝胶电泳，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。i地方黄牛品种serpina3基因部分dna序列的克隆

1、黄牛样本采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：皮南牛(311)，青海黄牛(143)，夏南牛(205)；

表1.黄牛样本的采集

2、血样基因组dna的提取

参考文献sambrocketal(2002)方法。

3、扩增引物设计

以ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.tov/)公布的牛serpina3基因序列(genbankaccessionno.ac_000170.1)为参考序列，通过引入酶切的方法，利用primer5.0设计pcr引物对p1，其引物序列如下：

上游引物：5’-tggctggagggatgtgacta-3’；

下游引物：5’-tcattattggttcaccataa-3’；

该引物对扩增了黄牛serpina3基因启动子区域。

4、pcr扩增

pcr反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的pcr反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mlpcr管中，然后加入模板dna(提取自血样样本的基因组dna)，再瞬时离心后进行pcr扩增；pcr反应体系见表2。

表2.pcr反应体系

buffer、taqdna聚合酶由上海生工生物工程股份有限公司提供；

pcr反应程序：

5、pcr产物测序

pcr扩增完成之后，将pcr扩增产物混合送上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序。对测序峰图进行分析发现如图2中的ag双峰，筛查到了黄牛serpina3基因的1个snp，位于黄牛serpina3基因第648位(648是启动子atg之前的第648个碱基，参考genbankaccessionno.ac_000170.1)。

ii、黄牛serpina3基因多态性的pcr-rflp检测

1、pcr反应条件

pcr扩增体系和反应条件分别如前所述，pcr扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳(120v电压电泳20-30min)图谱如图1所示，可以清晰的看到148bp的条带。

2、pcr-rflp检测

对于以引物对p1进行pcr扩增得到的扩增片段分别用限制性内切酶bstxi(宝生物工程有限公司)进行酶切处理(45℃，12-16h，酶切体系见表3)，然后根据3.5％琼脂糖凝胶电泳结果判定其多态性(120v电压电泳50min，用bio-rad凝胶成像分析系统照相分析、记录)。

表3.酶切反应体系

由于黄牛为二倍体动物，当发生突变时，可形成不同的基因型，可以通过琼脂糖凝胶电泳结果来进行基因型判别，aa基因型表现为148bp一个条带；ag基因型表现为148bp、130bp和18bp三个条带；gg基因型表现为130bp和18bp两个条带；其中，gg基因型为突变纯合基因型；如图3所示，根据条带的带型能够将三种基因型区分开(18bp条带过小，在电泳结果中无法体现，但不影响基因型的判别)，从而检测snp。

iii、不同基因型的群体遗传统计分析和与生长性状的关联分析

1、群体多态性检测

利用以上snp多态性检测方法对皮南牛(311)、青海黄牛(143)、夏南牛(205)基因组dna样品分别进行pcr-rflp检测，判定基因型。

2、snp位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。paa＝naa/n，其中paa代表某一位点的aa基因型频率；naa表示群体中具有aa基因型的个体数；n为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：pa＝(2naa+naa1+naa2+…+naai…+naan)/2n。式中，pa表示等位基因a频率，naa表示群体中具有aa基因型的个体数量，naai表示群体中具有aai基因型个体数量，ai＝a1,…,an为等位基因a的n个不同的复等位基因。统计结果见表4。

表4.三个黄牛品种serpina3基因多态位点的基因型和等位基因频率

3、基因效应的关联分析

采用spss17.0(statisticalproductandservicesolutions,version17.0edition)统计软件，对其中主要性状记录比较全面的夏南牛的不同基因型个体与体尺数据(来自河南省泌阳县夏南牛科技有限公司)进行了显著性检验。

1)测定的主要性状包括：体重，体高，体斜长，十字部高，胸围，腰/腹围，管围。

2)关联分析一般线性的模型：调用spss17.0软件一般线性模型tlm(generallinearmodelsprocedure)对各基因型对生长性状的影响进行显著性检验。依据本实验的其体情况建立如下统计模型：

yijk＝μ+ai+tj+eijk,

其中：yijk：个体表型记录；μ：总体均数；ai：年龄效应；tj：基因型效应；eijk：随即误差。

结果见表5，从表5可以看出基因型ag的成年牛管围显著高于基因型aa，基因型aa的成年牛胸围显著高于基因型ag。

表5.夏南牛serpina3基因不同基因型之间最小二乘均值差异显著性检验

注：表中数值为平均值±标准误(mean±s.e)；在同一行中标有a、c为差异显著水平p＜0.05；

因此，上述serpina3基因的snp位点可以作为中国地方黄牛品种(特别是夏南牛)的一个分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

<110>西北农林科技大学

<120>一种检测黄牛serpina3基因单核苷酸多态性的方法及其应用

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<212>dna

<213>人工合成

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