一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的反向探针、试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的反向探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是由基因组单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，是在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象。SNP在人类基因组中可达到300万个，平均约每21250个碱基对就会有一个SNP位点。研究表明SNP与多种疾病的发生相关，而快速、渐变的检测这些具有生物学意义的SNP是准确医疗诊断的基础和前提。一方面，SNP检测可参考已有的基因组序列进行，目的相对明确但另一方面，SNP鉴定需检测基因组DNA序列上特定核苷酸的转化、颠换、插入或缺失情况，对检测灵敏度、通量以及准确性等都有特殊的要求。

截止目前，已报导的SNP检测方法将近百种。其中较常用的方法有以下几大类：首先，是1995年Livak研究小组报导TaqmMan探针SNP分型法，这种通过将荧光发色团和淬灭集团偶联在SNP探针的两端，通过对SNP区域的RT-PCR实现对探针切割，从而通过检测RT-PCR过程红产生的荧光信号种类区分等位基因的SNP类型。这种方法具有分析简单的特点，已被广泛应用于多样本单一SNP位点的检测，但其探针较为昂贵。其次，适宜凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法，如：限制性片段多态性法PCR-RFLP、单链构象多台性法PCR-SSCP、变性梯度凝胶电泳。另外，随机扩增多态性(RAPD)和寡核苷酸连接分析(OLA)也是较为常用的方法，这几种方法检测信息准确，但都较为繁琐。再次，是近些年来发展起来的，高通量、自动化程度较高的检测SNP的方法，例如：DNA测序法、DNA芯片检测、飞行质谱仪检测(MALDI-TOFMS)、变性高效液相色谱(DHPLC)法等等的高通量分析，其中直接测序最容易实施的SNP检测方法，而MALDI-TOFMS是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后，在硅芯片上进行引物的退火、延伸，突变为点配对的碱基与正常配对的碱基不同，在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。

这些方法各具优势，具有操作简便、检测特异性高、高通量或高精度等特点，但对实验仪器均有特殊要求和较高的依懒性，检测耗时，操作繁琐，局限了其应用的灵活性和范围。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的反向探针；

本发明的另一目的在于提供一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的试剂盒；

本发明的第三目的在于提供及一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的反向探针，包括H1序列、H2序列、P1序列和G-四链体结构，所述H1序列为待检测序列单核苷酸多态性位点5’端的反向互补序列，所述H2序列为待检测序列单核苷酸多态性位点3’端的反向互补序列，所述P1序列为待检测序列通用引物的反向互补序列，所述G-四链体结构为待检测序列G-四链体基因的反向互补序列；所述反向探针从5’端起依次为H1序列、P1序列、G-四链体结构、H2序列。

含有上述的可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的反向探针的试剂盒。

采用上述反向探针可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的检测方法，它包括以下步骤：

S1.设计探针：根据待检测基因组DNA设计如上所述的反向探针；

S2.探针环化：PCR管中将基因组DNA与反向探针混合后，加热使DNA解链，然后置于退火温度，反向探针H1序列和H2序列与基因组单核苷酸多态性位点两端的序列杂交配对，形成具有一个缺口的环状结构；

S3.探针延伸：添加dNTPs，与单核苷酸多态性位点互补的单脱氧核苷酸在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下形成环状结构；

S4.探针扩增：添加通用引物和φ29DNA聚合酶，进行滚环扩增；探针中的G-四链体结构被大量循环放大扩增出来；

S5.颜色检测：加入显色反应试剂，通过颜色反应检测单核苷酸多态性位点的碱基，其中，基因组单核苷酸多态性位点即为与出现颜色反应的单核苷酸多态性位点探针相同的核苷酸。

进一步地，所述待检测基因组DNA为致倦库蚊乙酰胆碱酯酶基因组。

进一步地，步骤S2中所述DNA解链的加热温度和时间为98℃加热3min，85℃加热30min，60℃加热60min，56℃加热120min；所述退火温度为85℃。

进一步地，所述显色反应试剂为双氧水、辅基氯化血红素和四甲基联苯胺。

本发明具有以下优点：本发明公开了一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的反向探针，结果简单、合成方便，可在单个PCR试管中完成SNP位点的检测，检测结果用肉眼直接观察颜色反应即可判断出结果。本发明提供的种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的检测方法操作简单、检测方便，而且使用成本低廉，适合野外、田间、现场直接检测和物种鉴定，进而进行种群遗传统计分析。

附图说明

图1为滚环扩增产物凝胶电泳检测图，其中M表示分子Maker；

图2为滚环扩增产物的颜色反应检测图，其中，样本NC表示的阴性对照是等体积的ddH₂O，样本PC表示的阳性对照含有等体积的G-四链体序列P2；

图3为尖音库蚊复合种乙酰胆碱酯酶基因的SNP位点对比序列图；图中箭头所指位点表示致倦库蚊与其他3个亚种的碱基组成不同，图中双箭头所覆盖区域表示与分子反向探针两端互补匹配部位。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

本发明用于检测致倦库蚊(Cx.p.quinquefasciatus)乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase-2，ace-2)基因的SNP位点。在中国，尖音库蚊复合种(Culex pipiens complex)由4个亚种组成，分别是致倦库蚊(Cx.p.quinquefasciatus)、淡色库蚊(Cx.p.pallens)、骚扰库蚊(Cx.p.molestus)和尖音库蚊指名亚种(Cx.p.pipiens)。四个亚种在形态学上极其难于区分，国际通用方法是通过乙酰胆碱酯酶基因的SNP位点进行分子鉴定。

(1)样本收集

致倦库蚊雄性个体，从四川省疾病预防控制中心获取。使用基因组DNA提取试剂盒(Transgen,北京)，依据说明书提取致倦库蚊基因组DNA。

(2)设计分子反向探针

用于检测致倦库蚊乙酰胆碱酯酶SNP位点的分子反向探针ACEquin MIP的序列如序列1所示，具体为序列为：

5’-GCCACAGCCATTCATGGTCATAGCTGTTTCCCCCAACCCGCCCTACCCACAATAAAGAGGT-3’其中，H1序列为：5’-GCCACAGCCATT，H1序列与尖音库蚊复合种ace-2基因SNP位点左侧/5’的序列反向互补；P1序列为：5’-CATGGTCATAGCTGTTTCC-3’；G-四链体结构序列为：

5’-CCCAACCCGCCCTACCCA-3’，H2序列为：5’-CAATAAAGAGGT-3’，H2序列与尖音库蚊复合种ace-2基因SNP位点右侧/3’的序列反向互补。

阳性对照G-四链体序列如序列2所示：

P2：5’-TTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTTGATGTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’

反向探针由南京金斯瑞公司合成。反向探针进行5’端磷酸化预处理：10pmol探针，10单位T4多聚核苷酸激酶(Takara)，12.5nmol ATP和1.25ul的T4多聚核苷酸激酶缓冲液(Takara)，总体积12.5uL。37℃加热45分钟，然后加热至85℃持续20分钟使酶失活。

(3)分子反向探针与基因组DNA环化杂交

基因组DNA的预准备：200ng基因组DNA，10pmol探针，2μl的T4连接酶缓冲液(Transgen)，双蒸水ddH₂O加样至总体积10μl。

基因组DNA的加热解链，然后逐步退火让探针与靶基因序列充分杂交。98℃加热3分钟，85℃加热30分钟，60℃加热60分钟，最后56℃加热120分钟。

(4)分子反向探针缺口填补与连接反应

反应试剂组成：300pmol dNTPs(Takara)，20nmol ATP(Takara)，4μl的T4连接酶缓冲液，100单位的T4连接酶(Transgen)，5单位的T4DNA聚合酶，2ul的T4DNA聚合酶缓冲液，补充ddH₂O至20uL。

每一个样本，添加一种dNTPs，加样顺序如下：样本S1添加的是dATP，样本S2添加的是dGTP，样本S3添加的是dCTP，样本S4添加的是dTTP，如表1所示。

表1：单脱氧核苷酸加样顺序

探针缺口填补与连接反应：56℃加热60分钟，72℃加热20min。

(5)滚环扩增

1μl的φ29DNA聚合酶聚合酶缓冲液，10pmol通用引物P1加入到每一个样本中。将混合物在95℃加热3分钟，冰浴15分钟，然后加入500pmol的dNTP，0.2μl的小牛血清(BSA)，5单位的phi29聚合酶，在30℃恒温4小时，最后在65℃加热10分钟灭活。

滚环扩增产物的凝胶电泳检测结果见图1所示。

(6)可视化检测

PCR试管中混合物(含滚环扩增产物)放置于室温，加入显色反应试剂：hemin(2uM)，TMB(1mM)和H₂O₂(8mM)，PCR试管中混合物随后发生颜色改变，10分钟内，TMB被氧化后发出450nm波段的蓝色，可被肉眼观察到，如图2所示。

(7)结果分析

如图3所示，图3为尖音库蚊复合种乙酰胆碱酯酶基因的SNP位点对比序列图。致倦库蚊、淡色库蚊、骚扰库蚊和尖音库蚊指名亚种的ace-2基因比对分析。图中箭头所指位点表示致倦库蚊与其他3个亚种的碱基组成不同。图中双箭头所覆盖区域表示与分子反向探针两端互补匹配部位。致倦库蚊乙酰胆碱酯酶基因中SNP位点信息是碱基A，其他3个亚种在该SNP位点的信息是碱基C。碱基A只与碱基T配对，实验中有4个加样顺序样本，只有样本S4含有单脱氧核苷酸dTTP，凝胶电泳实验结果显示只有样本S4滚环扩增出产物，而且可视化检测结果显示样本S4具有显著性的颜色差异。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种可视化检测基因序列中单核苷酸多态性位点的反向探针、试剂盒及其检测方法

<130> 2016

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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