专利名称：一种基于SNPs标记的牛肉DNA溯源方法
技术领域：
本发明属于生物技术中的遗传工程技术领域，具体涉及一种基于SNPs(多个单核苷酸多态性)标记的牛肉DNA溯源方法。
背景技术：
食品安全是关系到国计民生的全球性重大问题，从90年代中期的食品安全危机开始，肉产品的追溯已经作为一种安全防护措施，获得欧共体各成员国的高度重视。通过肉产品的溯源管理，能够为消费者提供准确而详细的有关产品的信息；有利于生产经营者发现安全隐患时能迅速确定存在安全隐患的肉产品的来源与去向，切断污染途径并及时召回 受污产品，防止污染物扩散，减少经济损失；一旦发生食品安全事故，有利于职能部门追究责任事故原因，从源头上解决肉产品生产的污染问题。用于肉产品溯源的技术方法很多，如标签溯源技术、同位素溯源技术、矿物元素指纹溯源技术、有机物溯源技术、虹膜特征技术和DNA溯源技术等。DNA溯源技术使用的分子标记有AFLP (扩增片段长度多态性)标记、SSR(微卫星)标记和SNP (单核苷酸多态性)标记。AFLP标记技术可以通过选用少量效率高的引物组合，在较短的时间内获得覆盖全基因组的AFLP标记，其主要特点是信息量大、多态性丰富、灵敏度高、可重复性强。1991年，研究者结合PCR技术创立SSR标记技术。SSR也称简单重复序，其串联重复的核心序列为
I 6bp，其长度一般较短，由于不同遗传材料中核心序列重复的次数不同，导致了 SSR长度的高度变异性，这正是SSR标记产生的基础。SNP标记是1996年美国学者提出的第三代DNA分子标记。SNP是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。SNP是可遗传的变异中最常见的一种，具有分布广、密度高的特点，平均约每1000个碱基便有I个SNP存在。AFLP具有的高度可靠性和操作简便性，但是AFLP存在着对模板反应表现迟钝、谱带可能发生错配与缺失、成本相对比较高等缺点，AFLP标记更适于品种指纹的鉴定、品种质量和纯度的检测；微卫星标记的等位基因众多，多态丰富。每个微型卫星标记的信息容量至少相当于3个SNPs甚至更多SNPs获得的信息容量，这是由于SSR标记等位基因数目较多，但也正因如此，使得SSR标记的带型复杂，给DNA指纹识别自动化和规模化带来困难；SNP标记因分布广泛，遗传稳定，并且适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记，并将逐步取代AFLP标记和SSR标记。SNP标记是基因组序列单个核苷酸发生变异而产生多态性的DNA分子标记，它是二等位基因多态，因此一个SNP理论上可以区分三个动物个体，包括两个纯合子和一个杂合子。SNP在基因组内分布十分广泛，如在哺乳动物中每500 IOOObp序列就有可能包含一个SNP，这为建立个体DNA指纹图谱奠定了理论依据。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足之处，提供一种基于SNPs标记的牛肉DNA溯源方法，本方法通过PCR反应和PCR-RFLP分析，选择出作为溯源标记的多个单核苷酸多态性SNPs，再由所有有效单核苷酸多态性SNP位点组成一个多个单核苷酸多态性SNPs板用做溯源标记以达到牛肉DNA溯源；本方法能够提供丰富的多态性信息，单核苷酸多态性SNP标记因分布广泛、遗传稳定、适宜高通量自动化分析。本发明实现目的的技术方案如下一种基于SNPs标记的牛肉DNA溯源方法，步骤如下(I)牛全血基因组DNA的提取；(2)PCR反应PCR扩增条件为94°C预变性4min ;94°C变性30s，退火30s，72°C延伸30s，共36个循环；最后72°C延伸IOmin ;不同的SNP基因的扩增引物和退火温度根据不同的 SNP 基因确定，SNP 基因为P0U1F1、MGAT2、LPL、PRDM16、PRKAG3、CACNA2DI、MYPN、
CAPN3、RARRES2 ；(3) PCR-RFLP分析将扩增成功的片段用于酶切反应，使用9种SNP基因对应的限制性内切酶，再用琼脂糖凝胶电泳检测，拍照统计基因型；(4)对作为溯源标记的SNPs位点进行检测；计算出每个单核苷酸多态性SNP的等位基因频率及杂合度；(5)将每一头来源牛作为溯源标记的SNPs位点信息进行记录；(6)步骤(5)中的某头牛的牛肉有问题，按前述⑴到⑷步骤方法对作为溯源标记的有效多个单核苷酸多态性SNPs位点进行检测；(7)将步骤(6)中检测到的信息与步骤(5)中记录的信息进行对比；(8)根据溯源标记的SNPs的特征信息追溯到牛肉来源。而且，所述基因MGAT2与RARRES2分别有两个SNP位点。而且，所述步骤(3)的酶切体系由IOyL PCR产物、IOU限制性内切酶和2μ L限制性内切酶Buffer组成，反应时间为l_2h。而且，所述步骤(I)提取牛血全DNA用苯酚/氯仿法。本发明的优点和效果是I、本发明根据各地肉牛品种分布特点，选择5种以上肉牛品种的牛作为实验对象，根据遗传多样性分布特点选择10个以上单核苷酸多态性SNP作为候选基因，通过PCR反应，PCR-RFLP分析，选择出作为溯源标记的多个单核苷酸多态性SNPs，再由所有有效单核苷酸多态性SNP位点组成一个多个单核苷酸多态性SNPs板用做溯源标记以达到牛肉DNA溯源；本方法能够提供丰富的多态性信息，单核苷酸多态性SNP标记因分布广泛、遗传稳定，且适宜高通量自动化分析。2、本发明提供的牛肉溯源是指从动物生长阶段开始对其保持一种标记，使其在屠宰、加工和销售等环节都能维持可识别状态并能随时追溯到牛的个体信息，一旦出现食品安全事故能够快速寻找原因，确定污染范围并召回产品，最大限度地减小事故影响、降低风险和损失。3、本发明采用9个单核苷酸多态性SNP所组成的单核苷酸多态性SNP板基因型个数理论上应为39，标记能够提供丰富的多态性信息，使分析结果更加准确。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。本发明的技术路线为单核苷酸多态性SNP标记是基因组序列单个核苷酸发生变异而产生多态性的DNA分子标记，本研究采用的是PCR-RFLP检测单核苷酸多态性SNP位点。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨，不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。选择出作为溯源标 记的多个单核苷酸多态性SNPs :计算出每个SNP在不同牛种中的H值，H值在O. 30以上的单核苷酸多态性SNP被认为是有效标记位点，再由所有有效单核苷酸多态性SNP位点组成一个多个单核苷酸多态性SNPs板用做溯源标记。本发明的具体实施方法为I、为建立牛肉DNA溯源管理系统而筛选合适的标记位点，本发明选择了 12个单核苷酸多态性SNP作为候选标记位点，以西门塔尔牛(30头)，夏南牛(20头)，南阳牛(20头)，鲁西黄牛(14头)，郏县牛(19头)，海福特牛(10头)，秦川牛(10头)，黒安格斯牛(10头)，共133头牛为材料检测每个单核苷酸多态性SNP，在这些牛种中等位基因的分布情况，采用PCR-RFLP的方法对单核苷酸多态性SNP位点进行检测分析，筛选出符合条件的单核苷酸多态性SNP位点。2、根据遗传多样性分布特点选择12个单核苷酸多态性SNP作为候选基因，如图表I所示，其中涉及与牛肉肉质性状相关的基因POUlFl (垂体释放因子I)、MGAT2 (单酰甘油转移酶2基因)、LPL(脂蛋白脂酶基因)、PRDM16(PR结构域家族的第16个成员)、PRKAG3 (AMP-蛋白激酶Y 3基因)、CACNA2DI (钙离子通道中的α 2和δ I亚基)、ΜΥΡΝ(肌钯蛋白基因)、CAPN3(钙蛋白酶3基因);与牛繁殖性状有关的基因RARRES2 (视黄酸受体响应器2基因)、GHR(生长激素受体基因)，其中MGAT2与RARRES2基因分别有两个SNP位点。3、选择多个单核苷酸多态性SNPs标记的条件作为多个单核苷酸多态性SNPs标记的条件为(I)变异度高，等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布差异小；(3)要求任意相邻的单核苷酸多态性(SNP)间的距离至少大于1Mb，保证SNPs间相互独立；(4)任意单核苷酸多态性(SNP)位点与SSR位点不存在任何关联；(5) SNP侧翼序列不存在任何变
巳升。4、牛全血基因组DNA的提取冷冻血样室温解冻，取O. 5mL血液，用苯酚/氯仿法提取DNA，琼脂糖凝胶电泳检测其浓度及完整性。5,PCR 反应PCR 扩增体系为 25 μ L，包括 IOXbuffer 2. 5 μ L (含 Mg2+)，IOymol/L上下游引物各1μ L(引物序列见表1)，2. 5mmol/L dNTP 2. O μ L, TaqDNA聚合酶O. 65U，50-100ng DNA模板(牛全血基因组DNA)，加超纯水至25 μ L。PCR扩增条件为94°C预变性4min ;94°C变性30s，退火30s，退火温度见表1，72°C延伸30s，共36个循环；最后72°C延伸IOmin0PCR产物由I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，要求条带清晰无杂带。6、PCR-RFLP分析将扩增成功的片段用于酶切反应，所使用的限制性内切酶如表I所示。酶切体系由10μ L PCR产物、IOU限制性内切酶Takara和限制性内切酶2 μ L Buffer组成，反应时间一般均为l_2h左右。酶切产物无需测序，直接3%琼脂糖凝胶电泳检测，拍照统计基因型。7、统计方法首先计算出每个单核苷酸多态性SNP的等位基因频率，假设一个群体中基因型AA有X头，AB有Y头，BB有Z头，那等位基因频率计算公式如A =(2X+Y)/2(X+Y+Z), B = (2Ζ+Υ)/2(Χ+Υ+Ζ)。杂合度的计算公式如下=H = I- Σ pi，可用于DNA溯源标记的单核苷酸多态性SNP要求H值大于O. 30。表2所示为12个单核苷酸多态性SNP标记在8个牛种中所显示的等位基因频率及杂合度。8、选择出作为溯源标记的单核苷酸多态性SNPs :在不同牛种中SNP7、SNP10、SNP12位点的多态性信息含量很低，不适合作溯源标记。SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP8、SNP9、SNPll位点中只有个别牛中的杂合度低于O. 3，多态性信息丰富，SNP5、SNP6虽然位于同一基因上，但两个位点之间相互独立，并不存在遗传连锁现象，这两个单核苷酸多态性SNP都可作为有效标记，因此共有9个单核苷酸多态性SNP位点可用于肉质溯源标记。单核苷酸多态性SNP标记一般是二等位基因，等位基因频率较为接近的单核苷酸多态性SNP可作为溯源系统的标记位点，这是由于此类标记能够提供丰富的多态性信息。 一组高效的单核苷酸多态性SNP应在可识别情况下使用较少的标记位点，这有利于节约资源和成本。根据公式计算每个单核苷酸多态性SNP在不同牛种中的H值，H值范围在O
O.50之间，H值越大表明多态性信息含量越丰富，H值在O. 30以上的单核苷酸多态性SNP被认为是有效标记位点，H值接近O. 50则认为是理想的标记位点。每个单核苷酸多态性SNP有三种基因型(AA，BB，AB型)，9个单核苷酸多态性SNP所组成的单核苷酸多态性SNP板基因型个数理论上应为39。9、多个单核苷酸多态性SNPs标记的牛肉DNA溯源A对所需溯源的牛肉在上市前按前述4到7步方法对作为溯源标记的有效单核苷酸多态性单核苷酸多态性SNP位点进行检测；B将每一头牛的作为溯源标记的有效单核苷酸多态性SNP位点信息进行记录；C上市后如某头牛的牛肉有问题，同样按前述4到7步方法对作为溯源标记的有效单核苷酸多态性SNP位点进行检测；D将步骤C中检测到的信息与步骤B中记录的信息进行对比，如与记录的信息一致，那么根据溯源标记的多个单核苷酸多态性SNPs的特征信息可以追溯到牛肉来源。表I 12个单核苷酸多态性SNP的引物序列及内切酶
权利要求
1.一种基于SNPs标记的牛肉DNA溯源方法，其特征在于步骤如下 (1)牛全血基因组DNA的提取； (2)PCR反应PCR扩增条件为:94°C预变性4min ;94°C变性30s，退火30s，72 °C延伸30s，共36个循环；最后72°C延伸IOmin ;不同的SNP基因的扩增引物和退火温度根据不同的 SNP 基因确定，SNP 基因为P0U1F1、MGAT2、LPL、PRDM16、PRKAG3、CACNA2DI、MYPN、CAPN3、RARRES2 ； (3)PCR-RFLP分析将扩增成功的片段用于酶切反应，使用9种SNP基因对应的限制性内切酶，再用琼脂糖凝胶电泳检测，拍照统计基因型； (4)对作为溯源标记的SNPs位点进行检测；计算出每个单核苷酸多态性SNP的等位基 因频率及杂合度； (5)将每一头来源牛作为溯源标记的SNPs位点信息进行记录； (6)步骤(5)中的某头牛的牛肉有问题，按前述(I)到(4)步骤方法对作为溯源标记的有效多个单核苷酸多态性SNPs位点进行检测； (7)将步骤(6)中检测到的信息与步骤(5)中记录的信息进行对比； (8)根据溯源标记的SNPs的特征信息追溯到牛肉来源。
2.根据权利要求I所述的基于SNPs标记的牛肉DNA溯源方法，其特征在于所述基因MGAT2与RARRES2分别有两个SNP位点。
3.根据权利要求I所述的基于SNPs标记的牛肉DNA溯源方法，其特征在于所述步骤(3)的酶切体系由10 μ L PCR产物、IOU限制性内切酶和2μ L限制性内切酶Buffer组成，反应时间为l_2h。
4.根据权利要求I所述的基于SNPs标记的牛肉DNA溯源方法，其特征在于所述步骤(I)提取牛血全DNA用苯酚/氯仿法。
全文摘要
本发明涉及一种基于SNPs标记的牛肉DNA溯源方法，本方法根据遗传多样性分布特点选择9个单核苷酸多态性SNP作为候选基因，通过PCR反应，PCR-RFLP分析，选择出作为溯源标记的多个单核苷酸多态性SNPs，再由所有有效单核苷酸多态性SNP位点组成一个多个单核苷酸多态性SNPs板用做溯源标记以达到牛肉DNA溯源。本方法能够提供丰富的多态性信息，单核苷酸多态性SNP标记因分布广泛，遗传稳定，并且适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记。
文档编号C12Q1/68GK102676660SQ201210126008
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者常颢, 鲁晓松 申请人:天津大元牛业集团有限公司