一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法及试剂盒与流程

文档序号:12109239阅读:522来源:国知局
一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法及试剂盒与流程

本发明属于分子遗传学领域,具体涉及一种基于RFLP(限制性片段长度多态性)检测牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的单核苷酸多态性的方法。



背景技术:

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的变化而引起的多态性,主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。SNP属于第三代分子标记,具有密度高、双等位基因、易实现自动化检测等优点。由于SNP具有其它标记无法比拟的优点,所以它作为一种研究工具已经在生命科学的各个领域得到广泛应用。

目前,检测SNPs主要采用以下几种方法,即DNA直接测序法、单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP法等。其中,PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术,在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割,然后进行琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分析,就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性,又克服了费用昂贵、操作繁琐、假阳性的缺点。

分子育种,即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS),是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择,对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中,通过对生长性状密切相关的、并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择,达到早期选种和提高育种值准确性的目的,从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

PCAF又名KAT2B,为p300/CBP相关因子,是一种转录辅助激活因子,具有乙酞基转移酶活性,在基因表达的转录激活、细胞循环阻滞和体外培养细胞的分化中起重要作用。PCAF参与前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的转录调控,提示PCAF可能调控牛的脂肪分化与沉积,影响牛的生长性状。

目前,关于牛PCAF基因遗传变异的研究,在中国牛群中尚未见相关报道。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种快速检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法及试剂盒,可用于牛分子育种中的标记辅助选择,进行早期选择,从而加快良种选育速度。

为达到上述目的,本发明采用了以下技术方案:

一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法,包括以下步骤:以包含PCAF基因的待测牛全基因组DNA为模板,以引物对P1、P2和P3为引物,分别PCR扩增含牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的单核苷酸多态位点的PCAF基因片段;然后采用限制性内切酶HindIII、ApaI和ApaI分别消化含牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的单核苷酸多态位点的PCR扩增产物,再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳;根据凝胶成像系统分析结果,鉴定牛PCAF基因在第61908位、第62131位和第73406位三个SNP位点的多态性。所述的牛PCAF基因单核苷酸多态性即包括:第61908位的T>C(g.T61908C)、第62131位的T>C(g.T62131C)、第73406位的C>T(g.C73406T)的碱基多态性。

所述的引物对P1、P2和P3序列信息如表1所示。

表1.PCR反应的引物信息

所述的PCR扩增条件为:25μL反应体系包括12.5μL的2×Taq PCR MasterMix(内含Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Buffer等),1μL(50ng/μL)牛血液基因组DNA,10μmol/L的P1、P2或P3对应上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.5μL。

所述的PCR反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,68℃退火30s,72℃延伸30s,退火温度在每个循环降低1℃,共18个循环;94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s,25个循环;72℃延伸10min。

所述的限制性内切酶的酶切体系为:PCR产物5μL,10×T Buffer 1.0μL,0.1%BSA 1.0μL,HindIII/ApaI(15U/μL)0.2μL,ddH2O 2.7μL,酶切消化条件:37℃恒温培养箱中消化8~10h。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0%。

所述的根据凝胶成像系统分析结果鉴定牛PCAF基因第61908位多态性为:TT基因型表现为21bp和57bp的条带;CC基因型表现为78bp的条带;TC基因型表现为78bp,57bp和21bp的条带。

所述的根据凝胶成像系统分析结果鉴定牛PCAF基因第62131位的单核苷酸多态性为:CC基因型表现为191bp和27bp的条带;TT基因型表现为218bp的条带;TC基因型表现为218bp的条带,191bp和27bp的条带。

所述的根据凝胶成像系统分析结果鉴定牛PCAF基因第73406位的单核苷酸多态性为:CC基因型表现为287bp和27bp的条带;TT基因型表现为314bp的条带;CT基因型表现为314bp,287bp和27bp的条带。

以GenBank Accession No.AC_000158.1为参考,检测的牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位3个SNPs与牛多种重要生长性状相关。

一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP试剂盒,包括用于分别扩增包含牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的SNP位点的PCAF基因片段的引物对P1、P2和P3,如表1所示。

所述试剂盒还包括12.5μL的2×Taq PCR MasterMix(内含Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Buffer等)和灭菌超纯水10.5μL

与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:

本发明提供的牛PCAF基因单核苷酸多态性检测方法,针对第61908位的内含子13中T到C的突变,PCR扩增PCAF基因内含子13区78bp的基因片段后,当由T突变成C时,不能形成HindIII识别位点,不能被切开;而没有发生突变时,则含有HindIII识别位点,可以被酶切形成21bp和57bp大小的条带。

本发明提供的牛PCAF基因单核苷酸多态性检测方法,针对第62131位和第73406位的T与C之间的突变,PCR扩增PCAF基因内含子13区和3’UTR的目的片段后,当多态位点为C碱基时,则形成ApaI识别位点,可分别被ApaI酶切形成191bp、27bp大小的条带和287bp、27bp大小的条带;而多态位点为T碱基时,则不能被ApaI酶切,则分别为218bp和314bp大小的条带。

因此,本发明中利用的HindIII、ApaI可快速鉴定3个多态位点,从而简单、快速、成本低、精确地检测牛PCAF基因单核苷酸的多态性,可用于牛的分子育种,便于肉牛生长性状的标记辅助选择,快速建立遗传资源优良的肉牛种群。

附图说明

图1是牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位多态位点的测序图。

图2是牛PCAF基因DNA片段及引物序列图,其中A、B、C分别为第61908位、第62131位、第73406位多态位点。图2A中上游引物中把原序列的G突变成A(加框)引入HindIII酶切位点(A^AGCTT);斜体加框为第61908位T突变成C的多态位点。图2B中上游引物中把原序列的T突变成G(加框)引入ApaI酶切位点(GGGCC^C);斜体加框为第62131位T突变成C的多态位点。图2C中上游引物中把原序列的C突变成G(加框)引入ApaI酶切位点(GGGCC^C);斜体加框为第73406位C突变成T的多态位点。

图3是牛PCAF基因酶切电泳结果图,其中A、B、C分别为第61908位、第62131位、第73406位多态位点PCR产物的酶切电泳结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明首先根据NCBI公布的牛PCAF基因序列(GenBank Accession No.AC_000158.1)设计引物,分别以3个中国牛类群的基因组DNA池为模板,进行PCR扩增,并对其纯化,测序。然后,进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点;其次,利用PCR-RFLP方法对待测群体进行多态位点检测;最后,根据在群体中检测到的基因型,进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析,筛选出与牛生长性状密切相关的分子标记。

1、牛样本采集

本发明具体以3个中国牛类群作为检测对象,具体采集样本见表2,采集时间为2015年10月:秦川牛(69头)、福牛(52头)、牦牛(48头)。福牛是牦牛与柴达木黄牛杂交所产生的雌犏牛,再与安格斯公牛交配所产生的后裔群体;

表2.牛样本的采集

2、基因组DNA的分离、提取、纯化

参考文献Sambrock et al(2002)方法。

3、扩增引物设计

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛PCAF基因序列(GenBank Accession No.AC_000158.1)为参考序列,利用Primer 5.0设计PCR引物分别扩增PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位多态位点(参见图1)的目的片段,由上海生工生物工程有限责任公司合成PCAF基因3对引物P1、P2、P3,其引物对序列信息见表1。

上游引物F1中,把原序列的G突变成A引入HindIII酶切位点(A^AGCTT);上游引物F2中,把原序列的T突变成G引入ApaI酶切位点(GGGCC^C),上游引物F3中,把原序列的C突变成G引入ApaI酶切位点(GGGCC^C);从而分别人为构建了HindIII、ApaI、ApaI的酶切位点,可使用PCR-RFLP方法进行基因型的判定(参见图2)。

4、PCR扩增

分别以3个品种共169头牛的基因组DNA为模版,用上述设计的引物对其进行PCR扩增,PCR反应体系采用混合加样法,即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数,算出各种反应组分的总量,加入到1个1.5mL离心管中,充分混匀后瞬时离心,再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中,然后加入模板DNA,再瞬时离心后进行PCR扩增;PCR反应体系见表3:

表3.PCR反应体系

PCR反应程序:

5、PCR产物酶切

对含牛PCAF基因第61908位的单核苷酸多态位点的PCR产物进行HindIII酶切,对含牛PCAF基因第62131位的单核苷酸多态位点的PCR产物进行ApaI酶切,对含牛PCAF基因第73406位的单核苷酸多态位点的PCR产物进行ApaI酶切,然后根据电泳结果判定其SNP多态性。

1)酶切体系为10μL:包括5μL PCR产物,10×Buffer 1μL,0.1%BSA 1.0μL,限制性内切酶3U,灭菌超纯水2.7μL;

2)酶切消化条件:37℃恒温培养箱中消化8~10h;

6、琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作3.0%的琼脂糖凝胶(已经加入核酸染料),点样后120V电压电泳40min;

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时,在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像;

3)根据凝胶成像系统分析结果,对各样品进行判型、记录其基因型。

牛PCAF基因第61908位的单核苷酸多态性为(参见图3A):TT基因型表现为21bp和57bp的条带;CC基因型表现为78bp的条带;TC基因型表现为78bp,57bp和21bp的条带。其中由于21bp条带较小,故在琼脂糖电泳分析中不易观察到,但通过78bp和57bp条带还是能够准确的鉴别CC基因型、TC基因型和TT基因型。

牛PCAF基因第62131位的单核苷酸多态性为(参见图3B):CC基因型表现为191bp和27bp的条带;TT基因型表现为218bp的条带;TC基因型表现为218bp,191bp和27bp的条带。其中由于27bp条带较小,故在琼脂糖电泳分析中不易观察到,但通过218bp和191bp条带还是能够准确的鉴别CC基因型、TC基因型和TT基因型。

牛PCAF基因第73406位的单核苷酸多态性为(参见图3C):CC基因型表现为287bp和27bp的条带;TT基因型表现为314bp的条带;CT基因型表现为314bp,287bp和27bp的条带。其中由于27bp条带较小,故在琼脂糖电泳分析中不易观察到,但通过314bp和287bp条带还是能够准确的鉴别CC基因型、CT基因型和TT基因型。

7、牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA=NAA/N,其中PAA代表某一位点的AA基因型频率;NAA表示群体中具有AA基因型的个体数;N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成:PA=(2NAA+NAa1+NAa2+NAa3+NAa4+……+NAan)/2N,式中PA表示等位基因A频率,NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量,NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量,a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在3个牛类群PCAF基因的第61908位、第62131位和第73406位SNP中,基因型频率及等位基因频率如表4所示。

表4.牛PCAF基因SNP的基因型和等位基因频率

8、牛PCAF基因SNP效应分析

基因型数据:PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位SNPs的基因型。

生长数据:福牛(母)6月龄体长、管围、十字部高;秦川牛(母)24月龄体高、胸宽、腰角宽、十字部高;牦牛(公)24月龄体重。

关联分析模型:先对数据进行描述分析,确定是否存在离群值;再利用最小二乘分析对数据校正;根据数据特征,应用SPSS 19软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型:

Yijk=μ+Gj+eijk

其中:Yijk为性状观察值,μ为总体均值,Gj为第j个单SNP标记基因型的固定效应,eijk为随机误差。

关联分析结果表明(见表5):牛PCAF基因第61908位SNP与福牛体长显著相关(P<0.05),优势基因型为TT;第62131位SNP与秦川牛胸宽、体高、腰角宽和十字部高显著相关(P<0.05),CC基因型的表型分别显著低于其他两种基因型,且该SNP与福牛管围极显著相关(P<0.01),而杂合子TC显著低于纯合子CC和TT;第73406位SNP则与牦牛体重极显著相关(P<0.01)。由此可见,PCAF基因的这3个SNP位点对牛生长发育有重要影响,TT基因型可以作为一个提高牛生长性状的候选分子遗传标记。

表5.PCAF基因3个SNPs与生长性状的关联分析

核苷酸序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种检测牛PCAF基因单核苷酸多态性的RFLP方法及试剂盒

<160> 6

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gggttcccac tgcacaggcc aagct 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtccatcaga cgcccccaca cagag 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

accttcaagg ccttttacat gcggg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tcaaagagga atggacacag gcaga 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctcttcccag tctcactttt gtggg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aggcacactg tttgatgagt ttcta 25

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