利用双重PCR技术筛选产发菜多糖重组酵母菌株的方法与流程

本发明属于生物分子技术领域，涉及一种高效准确筛选产发菜多糖重组酵母菌株的方法，具体涉及一种利用双重PCR技术筛选产发菜多糖重组酵母菌株的方法。

背景技术：

目前，重组菌株的筛选方法主要有BTB显色法、代谢产物定性法等，这些方法有的虽被广泛采用，但筛选对象不同所选用的方法也不同。重组菌株代谢产物大多具有酸碱性质，且产量较大，可使用代谢产物定性法进行筛选。但是发菜多糖在培养液中呈中性，且代谢产物产量少，常规筛选方法不仅费时、困难，而且会影响试验结果。此外，关于发状念珠藻功能成分发菜多糖的生物合成相关基因的研究报道较少。因此，选择合适的筛选方法至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用双重PCR技术筛选产发菜多糖重组酵母菌株的方法，筛选较为容易、省时，且不影响试验结果。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种利用双重PCR技术筛选产发菜多糖重组酵母菌株的方法，具体按以下步骤进行：

步骤1：利用酵母DNA提取试剂盒提取发菜酵母重组菌株，提取重组菌株基因组DNA；

步骤2：设计引物序列为5’-3’ 的引物1和引物序列为5’-3’ 的引物2；

步骤3： PCR总体积为25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物 1.0μL，下游引物1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水补足；反应程序：94 ℃变性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18个循环；72 ℃延伸2 min；进行单重PCR扩增：

步骤4：模板 DNA 3μl，双重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；扩增PCR 反应程序为 94℃变性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，进行 20 个循环；最后 72℃延伸 2min，4℃保温，进行双重PCR扩增，扩增产物在 -20℃保存；

步骤5：对Pho1 F/R和Pho2 F/R两对引物进行引物配比，双重PCR扩增体系为：模板 DNA 3μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，引物浓度分别为1.5μl，加 ddH₂O 至25μl，扩增PCR 反应程序为：94℃变性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，进行 20 个循环；最后 72℃延伸 2min，4℃保温；

步骤6：用步骤5得到的双重PCR扩增体系，对产发菜多糖重组酵母菌株进行筛选。

本发明筛选方法根据发状念珠藻N. flagelliforme（简称发菜）光合作用基因相关酶基因序列，设计合成了2对特异性引物（Pro1基因和Pro2基因），分别建立Pro1和Pro2基因的单重PCR扩增方法。在单重PCR基础上通过对PCR扩增条件的优化，建立了筛选产发菜多糖酵母重组菌株的双重PCR检测方法，即利用一次PCR反应，从重组酵母菌株中可同时扩增出2条大小分别为800 bp（Pro1基因）、550 bp（Pro2基因）的特异性片段，而以酵母基因组DNA作为对照组扩增结果为阴性。利用该筛选方法可在同一管中同时扩增出Pro1和Pro2两对基因，大大节省了筛选时间和筛选成本，通过扩增两个相关基因，检测相关基因的分布状况，在基因型上快速、高效、准确的对发菜酵母重组菌株进行高通量筛选。为远缘、超远缘基因重组细胞的筛选提供了切实可行的生物分子筛选检测方法。该筛选方法是一种从基因型上高效、准确筛选发菜酵母重组菌株的方法。

附图说明

图1是本发明筛选方法中引物1的单重PCR凝胶电泳图。

图2是本发明筛选方法中引物2的单重PCR凝胶电泳图。

图3是发明筛选方法中双重PCR凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

由于发菜多糖在培养液中呈中性，且代谢产物产量少，采用常规筛选方法筛选酵母重组菌株时，不仅费时、筛选困难，而且影响试验结果。为了客服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种筛选省时容易，对试验结果影响不大的筛选产发菜多糖重组酵母菌株的方法，该筛选方法具体按以下不在进行：

步骤1：重组菌株基因组DNA的 提取：利用酵母DNA提取试剂盒提取发菜酵母重组菌株，提取重组菌株基因组DNA；

步骤2：引物的设计与合成：双重PCR所用引物：引物1引物序列(5’-3’) ，（F：ACCACCTTCGTCACCTCT， R：GGATACCCTCGTTCAGCA），如图1所示，通道1#、2#、3#以发菜基因组DNA作为模板添加引物1进行单重PCR在800bp出现条带，通道4#、5#、6#以酵母基因组DNA作为模板添加引物1进行单重PCR在800bp没有出现条带；引物2引物序列(5’-3’) ，（F：TAGGAAGAAGCGAAAGCG，R：CAGTTGATGGAATGGGTG），如图2所示，通道1#、2#、3#以发菜基因组DNA作为模板添加引物2进行单重PCR在550bp出现条带，通道4#、5#、6#以酵母基因组DNA作为模板添加引物2进行单重PCR在550bp处没有出现条带；

引物1和引物2的序列信息表，如表1所示。

表1 引物序列信息表

步骤3：单重PCR扩增条件：PCR总体积为25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物（10μmol/L） 1.0μL，下游引物（10μmol/L）1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水补足；反应程序：94 ℃变性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18个循环；72 ℃延伸2 min；

步骤4：双重PCR扩增条件：PCR 反应其它参数采用以下体系进行扩增：模板 DNA 3μl，双重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；扩增PCR 反应程序为 94℃变性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，进行 20 个循环；最后 72℃延伸 2min，4℃保温，扩增产物在 -20℃保存；

如图3所示，通道1#、2#、3#以发菜基因组DNA作为模板添加引物1和引物2进行双重PCR在800bp和550bp均出现条带，条带单一清晰；而通道4#、5#、6#以酵母基因组DNA作为模板添加引物1和引物2进行双重PCR在800bp和550bp处没有出现条带。

步骤5：用步骤4得到的双重PCR扩增体系，对产发菜多糖重组酵母菌株进行筛选。

本发明筛选方法采用双重PCR高通量筛选体系，可以在基因型上快速、高效、准确的对发菜酵母重组菌株进行高通量筛选。为远缘、超远缘基因重组细胞的筛选提供了切实可行的生物分子筛选检测方法。

实施例

利用酵母DNA提取试剂盒提取发菜酵母重组菌株，提取重组菌株基因组DNA；引物1引物序列(5’-3’) ，（F：ACCACCTTCGTCACCTCT， R：GGATACCCTCGTTCAGCA）；引物2引物序列(5’-3’) ，（F：TAGGAAGAAGCGAAAGCG，R：CAGTTGATGGAATGGGTG）；单重PCR扩增条件：PCR总体积为25μL，其中包括2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，上游引物（10μmol/L） 1.0μL，下游引物（10μmol/L）1.0μL，模板 DNA 1.5μL，其余用水补足；反应程序：94 ℃变性2 min；94 ℃20 s ，52 ℃ 25 s ，72 ℃ 30 s，18个循环；72 ℃延伸2 min；PCR 反应其它参数采用以下体系进行扩增：模板 DNA 3μl，双重引物上下游各加1.5μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，加 ddH₂O 至25μl；扩增PCR 反应程序为 94℃变性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，进行 20 个循环；最后 72℃延伸 2min，4℃保温，扩增产物在 -20℃保存；对Pho1 F/R和Pho2 F/R两对引物进行引物配比，最终确定体系为：模板 DNA 3μl，2×Taq PCRMaster Mix 10.5μL，引物浓度分别为（10μM）为1.5μl，加 ddH₂O 至25μl，扩增PCR 反应程序为：94℃变性 2min；然后 94℃，20sec、52℃，25sec、72℃，30sec，进行 20 个循环；最后 72℃延伸 2min，4℃保温；用双重PCR扩增体系，对产发菜多糖重组酵母菌株进行筛选。

本发明筛选方法的优越性：

1）与传统重组菌株的筛选方法，如代谢产物分析法相比，双重PCR高通量筛选体系可以一次性扩增和筛选96个重组菌株，大大缩短筛选时间，节省筛选成本，提高筛选效率，实现高通量筛选。

2）与传统重组菌株筛选方法，如代谢产物显色法相比，双重PCR高通量筛选体系从基因角度对重组菌株进行筛选，筛选方法更加准确，可行度好。

3）与传统重组菌株的筛选方法，双重PCR高通量筛选体系可以短时间完成整个实验筛选过程，防止长时间筛选过程对菌种的污染，减少污染率和菌种的储藏成本。